Untersuchung humaner Stammzellen aus dem adulten Knochenmark und ...

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Untersuchung humaner Stammzellen aus dem adulten Knochenmark und der fetalen Leber Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Fakultät für Biologie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau vorgelegt von Stefan Kaiser geboren in Bad Säckingen Dezember 2004
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Untersuchung humaner Stammzellen aus
dem adulten Knochenmark und der fetalen
Leber









Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde
der Fakultät für Biologie
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau





vorgelegt von Stefan Kaiser

geboren in Bad Säckingen

Dezember 2004








Diese Arbeit wurde in der Abteilung Innere Medizin I des Universitäts-
klinikums Freiburg unter der Leitung von PD Dr. Ursula Kapp angefertigt.


























Dekan: Prof. Dr. G. Fuchs
Promotionsvorsitzender: Prof. Dr. K.-F. Fischbach
Betreuer der Dissertation an der Fakultät für Biologie:
Prof. Dr. A. E. Sippel
Betreuerin der Dissertation in der Abteilung Innere Medizin I:
PD Dr. U. Kapp
Coreferent: Prof. Dr. C. Peters
Drittprüfer: PD Dr. D. Meyer


Tag der Verkündung des Prüfungsergebnisses: 17.2.2005


1 Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 7
1.1 Stammzellen 7
1.2 Hämatopoetische Stammzellen und CD34 8
1.3 Mesenchymale Stammzellen 10
1.4 Transdifferenzierung und Stammzellplastizität 14
1.5 Fetale Leber als Quelle für hämatopoetische und mesenchymale 15
Stammzellen
1.6 Immundefiziente Mausstämme als Modellsysteme für die 18
Stammzellforschung

2 Zielsetzung und Fragestellungen 23
2.1 Mesenchymale Stammzellen aus adultem humanem Knochenmark 23
2.2 Fetale Leber als Ausgangsmaterial zur Gewinnung von mesenchymalen 24
und hämatopoetischen Stammzellen
2.3 Anwendung von Mausmodellen zum Nachweis von multipotenten, 24
adulten, humanen Stammzellen

26 3 Material und Methoden
3.1 Material 26
3.1.1 Geräte 26
3.1.2 Gebrauchswaren 27
3.1.3 Medien 28
3.1.4 Zytokine, Mediumzusätze und Differenzierungsfaktoren 29
3.1.5 Antikörper 30
3.1.6 Molekularbiologische, immunologische und Färbungs-Kits 31
3.1.7 Enzyme 31
3.1.8 Oligonukleotide 31
3.1.9 Sonstige Reagenzien und Chemikalien 32
3.1.10 Puffer und Lösungen 33
3.1.11 EDV-Programme 34
3.1.12 Bakterien 34
3.1.13 Mausstämme 35
2 3.1.14 Humanes Zellmaterial 35
3.1.14.1 Knochenmark 35
3.1.14.2 Plazentarestblut 35
3.1.14.3 Fetale Leber 35
3.1.14.4 Endothelzellen 35
3.1.14.5 Fibroblasten 36
3.2 Methoden 37
3.2.1 Zellbiologische Methoden 37
3.2.1.1 Isolierung von mononukleären Zellen aus humanem 37
Knochenmark
3.2.1.2 Isolierung von mononukleären Zellen aus Nabelschnurblut 38
3.2.1.3 Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen 38
3.2.1.4 Kultivierung von Endothelzellen 39
3.2.1.5 Kultivierung von hämatopoetischen Stammzellen aus fetaler 39
Leber
3.2.1.6 Einfrieren und Auftauen von Zellen 40
3.2.1.7 Immunomagnetische Zellseparation 40
3.2.1.8 Durchflußzytometrie 41
3.2.1.9 Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung 43
3.2.1.10 In vitro Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen 45
3.2.1.11 Alkalische Phosphatase Färbung 46
3.2.1.12 Oil Red O Färbung 47
3.2.1.13 Chromosomenpräparation 48
3.2.1.14 Fluoreszenz in situ Hybridisierung 49
3.2.1.15 Retroviraler Gentransfer 49
3.2.2 Mausexperimente 52
3.2.2.1 Transplantation von Stammzellen in NOD/SCID- und 52
PNOD/SCID-Mäuse
3.2.2.2 Gewinnung von peripherem murinem Blut 53
3.2.2.3 Gewinnung von murinem Blutserum 53
3.2.2.4 Messung des IgG-Gehaltes im murinen Blutserum 53
3.2.2.5 Differentialblutbild 53
3.2.2.6 Zytotoxizitätstest 53
3.2.2.7 Präparation von murinen Blutzellen für die FACS-Analyse 54
3 3.2.2.8 Limited dilution assay in der NOD/SCID-Maus 54
3.2.3 Molekularbiologische Methoden 55
3.2.3.1 Bakterienkultur 55
3.2.3.2 Bakterientransformation 56
3.2.3.3 Plasmid-Präparation 56
3.2.3.4 Restriktionsverdau von Plasmid-DNA 56
3.2.3.5 Agarose-Gelelektrophorese 56
3.2.3.6 Isolierung genomischer DNA 57
3.2.3.7 RNA-Isolation 57
3.2.3.8 Bestimmung des RNA-Gehaltes 58
3.2.3.9 Reverse Transkription 58
3.2.3.10 PCR 58
3.2.3.11 Southern Blot 61
3.2.4 Statistik 61

4 Ergebnisse 62
4.1 Mesenchymale Stammzellen aus Knochenmark 62
4.1.1 In vivo Phänotyp 62
4.1.1.1 Zellsortierungen nach CD34 62
4.1.1.2 Zellsortierungen nach CD34 und CD45 66
+4.1.1.3 Bestimmung des Ploidiegrades von MSC aus der CD34 und 71
+ +
CD34 CD45 Fraktion
4.1.2 Differenzierungspotenzial 71
4.1.2.1 Endotheliales Differenzierungspotenzial unseparierter MSC 71
4.1.2.2 Endotheliales Differenzierungspotenzial von MSC aus den 74
+ + - - Subfraktionen CD45 CD34 und CD45 CD34
4.1.2.3 Hämatopoetisches Differenzierungspotenzial 75
4.1.3. Transduktion von mesenchymalen Stammzellen mit CD34 77
4.1.3.1 Bestimmung der Transduktionseffizienz 77
4.1.3.2 Transduktion mit CD34 78
4.1.3.3 Differenzierungspotenzial von CD34-transduzierten MSC 80
4.1.3.4 Repopulationsverhalten von CD34-transduzierten humanen 85
MSC in der NOD/SCID-Maus

4 4.2 Humane fetale Leber als Ausgangsmaterial zur Gewinnung von 89
mesenchymalen und hämatopoetischen Stammzellen
4.2.1 Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus fetaler Leber 89
4.2.2 Langzeitexpansion humaner hämatopoetischer Stammzellen aus 94
fetaler Leber
4.2.2.1 Kurz- und Langzeitrepopulationsverhalten von SRC aus 94
expandierter fetaler Leber
4.2.2.2. Ermittlung der Frequenz von SRC in nicht expandierter 98
fetaler Leber
4.2.2.3 Ermittlung der Frequenz von SRC in expandierter fetaler 99
Leber
4.2.2.4 Ermittlung der Expansionsrate von in vitro expandierten SRC 101
aus fetaler Leber
4.3 Charakterisierung der PNOD/SCID-Maus 102
4.3.1 Zytotoxizitätstest 102
4.3.2 Analyse von Milz, Knochenmark und peripherem Blut 103
4.3.3 Serum-IgG Gehalt 105
4.3.4 Repopulationsverhalten von SRC in der PNOD/SCID-Maus 106

5. Diskussion 110
5.1. Mesenchymale Stammzellen aus adultem Knochenmark 110
5.1.1 In vivo Phänotyp mesenchymaler Stammzellen 110
5.1.2 Differenzierungspotenzial mesenchymaler Stammzellen 113
5.1.3 CD34-transduzierte mesenchymale Stammzellen 115
5.1.4 Plastizität und Bedeutung mesenchymaler Stammzellen aus dem 117
Knochenmark
5.2 Stammzellen aus fetaler Leber 119
5.2.1 Fetale Leber als Quelle für mesenchymale Stammzellen 119
5.2.2 Langzeitexpansion humaner hämatopoetischer Stammzellen aus 120
fetaler Leber
5.3 Charakterisierung der PNOD/SCID-Maus 122

6 Zusammenfassung 125

5 7 Literatur 127

8 Anhang 138
8.1 Abkürzungen 138
8.2 CD-Antigene 143
8.3 Publikationen und Kongreßbeiträge 144
8.4 Lebenslauf 146
8.5 Danksagung 147

































6 1 Einleitung

1.1 Stammzellen
Als Stammzellen werden im allgemeinen diejenigen Zellen eines Organismus bezeichnet, die
die Fähigkeit besitzen, durch Zellteilung zwei verschiedene Typen von Nachkommen zu
erzeugen. Der eine Typus eines Nachkommen ist eine Tochterzelle, welcher das identische
Abbild der Mutterzelle darstellt. Diese Tochterzelle besitzt exakt die gleichen Eigenschaften
wie die Mutterzelle. Der Vorgang, bei welchem diese Art von Nachkommenschaft erzeugt
wird, wird als Selbsterneuerung bezeichnet. Der zweite Typus eines Nachkommens, der bei
der Teilung einer Stammzelle entstehen kann, ist eine Tochterzelle, deren Eigenschaften mit
denjenigen der Mutterzelle nicht mehr identisch sind. In der Regel ist diese Tochterzelle eine
reifere Zelle, deren Eigenschaften sie zu spezifischen Aufgaben im Organismus befähigt, zu
welchen die Mutterzelle nicht befähigt war. Der zweite entscheidende Unterschied zwischen
der Mutterzelle und der Tochterzelle von diesem Typus ist, daß die Tochterzelle die
Eigenschaft der Selbsterneuerung nicht mehr besitzt. Der Vorgang, bei welchem dieser Typus
einer Tochterzelle entsteht wird als Differenzierung bezeichnet. Die Fähigkeit der
Selbsterneuerung und der Differenzierung sind somit die beiden Kriterien, welche alle
Stammzellen verbindet.
Eine weitere Unterteilung der Stammzellen kann durch die Klassifizierung des
1Differenzierungspotenzials erfolgen. So werden Stammzellen, welche die Fähigkeit besitzen,
eine Nachkommenschaft zu erzeugen, welche alle embryonalen und extraembryonalen
Zelltypen einschließt, als totipotent bezeichnet. Extraembryonale Strukturen, wie
beispielsweise die Plazenta, werden vom Trophoektoderm gebildet. Das Trophoektoderm und
die innere Zellmasse, aus welcher sich der eigentliche Embryo entwickelt, sind die beiden
Zellgruppen, die aus den ersten Furchungsteilungen hervorgehen. Ab dem Zeitpunkt, an
welchem die Auftrennung in diese beiden Zellgruppen stattgefunden hat, dem Stadium der
Blastocyste, finden sich innerhalb der inneren Zellmasse nur noch Zellen, die dazu befähigt
sind, durch Teilung und Differenzierung alle Zelltypen des eigentlichen Embryos, nicht aber
extraembryonale Strukturen, zu erzeugen. Die Differenzierungsfähigkeit dieser Zellen wird
folglich nicht mehr als totipotent, sondern als pluripotent bezeichnet. Pluripotente murine
Zellen wurden erstmals durch in vitro Kultivierung von Zellen der inneren Zellmasse der
Blastocyste gewonnen, jedoch ist es bisher noch unklar, ob alle Zellen der inneren Zellmasse
2,3pluripotent sind oder nur einzelne Zellen innerhalb der inneren Zellmasse.
7 Bisher konnten pluripotente Zellen zweifelsfrei nur aus embryonalem Gewebe isoliert
werden. Stammzellen, welche in adulten Geweben lokalisiert sind, werden durch drei weitere
Begriffe klassifiziert, die weniger exakt definiert sind und oftmals von verschiedenen Autoren
unterschiedlich verwendet werden. So werden im allgemeinen Zellen, welche zwar nicht in
alle Zelltypen des adulten Organismus, jedoch in viele verschiedene Zelltypen differenzieren
können, als multipotent bezeichnet. Oligopotente Stammzellen können in zwei oder mehrere
Zelltypen differenzieren, während eine unipotente Stammzelle oder Progenitorzelle nur dazu
befähigt ist, einen ausgereiften Zelltyp hervorzubringen. Adulte Stammzellen existieren in
einer Vielzahl von Organen. Gewebespezifische Stammzellen konnten beispielsweise in den
Darmkrypten des Verdauungstraktes, in der Epidermis der Haut, in der Leber, im Herzmuskel
4-7
oder im Nervensystem gefunden werden. Die Aufgabe der adulten Stammzellen in den
jeweiligen Geweben ist die Nachbildung und Bereitstellung neuer Zellen als Ersatz für
absterbende Zellen. Besonders auffällig ist diese Notwendigkeit in Geweben und Organen mit
hohem Zellumsatz wie der Haut, dem Darmepithel oder dem Blut.

1.2 Hämatopoetische Stammzellen und CD34
Die bis heute am ausgiebigsten und besten erforschten Stammzellen sind zweifelsohne die
hämatopoetischen Stammzellen. Dies liegt zum einen an der leichten Zugänglichkeit dieser
Zellen, zum anderen an der Tatsache, daß viele Erkrankungen des Menschen wie Leukämien,
aplastische Anämien, Lymphome, Myelodysplasien oder angeborene Stoffwechsel-
erkrankungen mit dem Blut und somit der Hämatopoese und den dafür verantwortlichen
8
Stammzellen in Zusammenhang stehen. Die Hämatopoese im adulten Menschen findet in
den drei Organen Milz, Thymus und Knochenmark statt, wobei in den ersten beiden Organen
die Ausreifung von Lymphozyten stattfindet, während die hämatopoetischen Stammzellen
unter normalen Bedingungen beim Erwachsenen nur im Knochenmark anzutreffen sind. Alle
im adulten Säugetierorganismus zirkulierenden Blutzellen haben ihren Ursprung in einer
Population von multipotenten Stammzellen. Das klassische Modell der Hämatopoese geht
von einem hierarchischen System aus, an dessen Spitze multipotente hämatopoetische
9-12Stammzellen stehen. Die sich stetig erneuernden hämatopoetischen Stammzellen bringen
myeloide und lymphoide Stammzellen hervor, welche über mehrere Zwischenstufen alle
13
ausgereiften Zellen des hämatopoetischen Systems erzeugen (Abb. 1). Im Gegensatz zum
murinen hämatopoetischen System ist es ungleich schwieriger die Biologie von humanen
hämatopoetischen Stammzellen zu erforschen. Da am lebenden Menschen nur eingeschränkt
Untersuchungen durchgeführt werden können, bedient man sich in vitro Experimenten wie
8 beispielsweise long-term culture-initiating cell (LTC-IC) assays, durch welche primitive
Zellen nachgewiesen werden können. Diese bringen auch noch nach fünf Wochen in vitro
14,15Kultivierung Kolonien-bildende Zellen (CFCs; colony-forming cells) hervor. Da in vitro
Versuche meist nur einen beschränkten Einblick in die Biologie der Stammzelle erlauben,
werden zunehmend Tiermodelle bei der Erforschung der humanen hämatopoetischen
Stammzellen eingesetzt. So sind die meisten Erkenntnisse, welche über den Phänotyp oder
das Repopulationsverhalten menschlicher hämatopoetischer Stammzellen zusammengetragen
wurden, das Ergebnis von Transplantationsexperimenten in immundefizienten Mäusen,
16-19
fetalen Schafen oder letal bestrahlten Primaten.



Multipotente Stammzelle

















Abbildung 1: Hierarchisches System der Hämatopoese. Aus multipotenten hämatopoetischen
Stammzellen, welche sich ständig selbst erneuern, gehen myeloide und lymphoide Stammzellen
hervor, aus welchen sich über Differenzierungszwischenstufen die acht verschiedenen Blutzelltypen
bilden. (verändert aus: Entwicklungsbiologie. Wolpert, Lewis. Heidelberg, Berlin: Spektrum
Akademischer Verlag; 1999)


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