Doctorat Discipline Sciences du Vivant

Quentin Vicens

Description

Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
Doctorat Discipline : Sciences du Vivant Quentin VICENS Soutenu le jeudi 19 décembre 2002 Jury : Pr Bernard EHRESMANN Président et examinateur Dr Jean-Pierre GUILLOTEAU Rapporteur externe Dr Alberto D. PODJARNY Rapporteur interne Pr Marina V. RODNINA Rapporteur externe Pr Eric WESTHOF Directeur de thèse Structures cristallographiques de complexes entre des fragments d'acides ribonucléiques comportant le site A ribosomique et des antibiotiques de la famille des aminoglycosides Université Louis Pasteur de Strasbourg Ecole Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé

• podjarny rapporteur interne


• recherche de conditions de renaturation


• cristallisation de complexes contenant la tobramycine


• cristallisation


• structures cristallographiques de complexes


• ecole doctorale des sciences de la vie et de la santé


• antibiotique

Sujets

• Alberto
• Marina
• Louis Pasteur University
• Cristallisation

Informations

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• Publié le: 01 décembre 2002
• Nombre de lectures: 121
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 35 Mo

Extrait

Université Louis Pasteur de Strasbourg Ecole Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé

Doctorat Discipline : Sciences du Vivant

Quentin VICENS

Structures cristallographiques de complexes entre des

fragments d’acides ribonucléiques comportant le site A

ribosomique et des antibiotiques de la famille des

aminoglycosides

Soutenu le jeudi 19 décembre 2002

Jury : Pr Bernard EHRESMANN Dr Jean-Pierre GUILLOTEAU Dr Alberto D. PODJARNY

Pr Marina V. RODNINA

Pr Eric WESTHOF

Président et examinateur

Rapporteur externe

Rapporteur interne

Rapporteur externe

Directeur de thèse

Remerciements

Table des matières

CHAPITRE 1 : INTRODUCTION

I. Origines et propriétés des antibiotiques A. Historique des maladies infectieuses et de leurs traitements e B. Les antibiotiques : une découverte scientifique majeure du XX siècle C. Classification générale des antibiotiques

II. Les aminoglycosides : généralités A. Classification des aminoglycosides B. Caractéristiques 1) Spectre d’action 2) Le site A comme cible cellulaire 3) Mode d’action C. Les traitements aux aminoglycosides : le revers de la médaille 1) Effets secondaires toxiques 2) Phénomènes de résistance

III. Etudes structurales et fonctionnelles de complexes site A/aminoglycosides A. Caractérisation biochimique 1) Concentrations minimales d’inhibition 2) Cartographie aux sondes chimiques 3) Constantes de dissociation B. Etudes par résonance magnétique nucléaire C. Etudes par cristallographie aux rayons X D. Confrontation des résultats des différentes études structurales

IV. Etudes structurales d’autres complexes

V. Revue des interactions ARN/aminoglycosides

VI. Présentation des résultats de ce travail de thèse

CHAPITRE 2 : STRUCTURES CRISTALLOGRAPHIQUES DE TROIS COMPLEXES SITE A/AMINOGLYCOSIDES

I. Les étapes depuis la conception jusqu’à la diffraction A. Conception des oligoribonucléotides B. Synthèses chimiques et purifications 1) Résultats 2) Problèmes de déprotection 3) Problèmes de purifications par HPLC C. Recherche de conditions de renaturation 1) Résultats des antibiogrammes 2) Résultats des expériences de fusion 3) Résultats des expériences par PAGE D. Cristallisation et premiers essais de diffraction 1) Cristallogénèse du fragment F3 2) Cristallogénèse des fragments F3 et A1 3) Cristallogénèse du fragment A3 4) Optimisation des conditions de cristallisation 5) Expériences de micro- et macro-ensemencement E. Cristallisation de différents complexes 1) Cristallisation de complexes contenant la tobramycine 2) Cristallisation de complexes contenant la généticine

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3) Cristallisation de complexes contenant différents aminoglycosides 4) Cristallisation en présence de cations, sans inhibiteur 5) Cristallisation d’autres fragments

II. Structure tridimensionnelle du complexe site A/paromomycine (Publication 1)

III. Structure tridimensionnelle du complexe site A/tobramycine (Publication 2)

IV. Structure tridimensionnelle du complexe site A/généticine (Publication 3)

CHAPITRE 3 : DIFFERENTS ASPECTS DE LA RECONNAISSANCE MOLECULAIRE DES AMINOGLYCOSIDES

I. Comparaison avec les aminoglycosides liés aux enzymes de résistance A. Analyse conformationnelle des aminoglycosides B. Structures tridimensionnelles des sites de fixation C. Implication des molécules d’eau dans la reconnaissance moléculaire D. Vers la conception de nouveaux inhibiteurs

II. Comparaison avec des oligosaccharides fixés par des protéines A. Vues générales des structures tridimensionnelles de quelques complexes B. Analyse structurale des sites de fixation

III. Rôle des molécules d’eau dans la reconnaissance

CHAPITRE 4 : CONCLUSIONS

CHAPITRE 5: PROTOCOLES EXPERIMENTAUX

I. Conception de fragments incorporant le site A de l’ARN 16S

II. Synthèse chimique d’ARN en phase solide A. Cycle de synthèse chimique B. Déprotection des oligoribonucléotides C. Calcul du rendement de synthèse

III. Purification et analyse des fragments d’ARN A. Chromatographie échangeuse d’ions B. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) 1) PAGE analytique 2) PAGE préparative C. Dosage de l’ARN D. Spectrométrie de masse MALDI-TOF

IV. Etudes de renaturation et de stabilité en solution des complexes ARN/aminoglycosides A. Températures de fusion B. Antibiogrammes C. Etude par PAGE

V. Cristallogénèse et cristallisation

VI. Cristallographie aux rayons X A. Résolution des structures tridimensionnelles B. Validation des structures tridimensionnelles

BIBLIOGRAPHIE

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Abréviations

A 260 ACE ADIT APS ARN ARNm ARNr ARNt ASWY ASR-27 CPG DMT DOS EDTA ESRF FMN HDV HIV HEPES HPLC K D

MALDI-TOF

MES MPD nt OY PAGE PDB PEG-400 PM RMN RMS RRE SA SIDA site A

Absorbance mesurée à la longueur d’onde de 260 nm 2’-bis-(acétoxyethoxy)-méthyle éther Auto dep. input tool (outil de déposition automatique) Ammonium persulphate (persulfate d’ammonium) Acide ribonucléique ARN messager ARN ribosomique ARN de transfert Average stepwise yield (rendement moyen par étape) Oligoribonucléotide de 27 nucléotides contenant le site A Controlled pore glass (bille de verre de diamètre contrôlé) Diméthoxytrityle Désoxystreptamine Acide éthylène diamine N,N,N’,N’-tétraacétique European synchrotron radiation facilityeuro (installation péenne de rayonemment synchrotron) Flavine mono-nucléotide Virus de l’hépatite delta Virus de l’immunodéficience humaine Acide N-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-N’-(2-éthanesulfonique) High pressure liquid chromatography (chromatographie en phase liquide à haute performance) Constante de dissociation Matrix assisted laser desorption ionization-time of flight (désorption-laser ionique assistée par matrice-mesure du temps de vol) Acide 2-(N-morpholino)-éthane sulfonique 2,4-méthylpentanediol Nucléotide Overall yield (rendement global) Polyacrylamide gel electrophoresis (electrophorèse sur gel de polyacrylamide) Protein Data Bank Polyéthylène glycol de poids moléculaire 400 Poids moléculaire Résonance magnétique nucléaire Root mean square (écart quadratique moyen) Rev responsive element Sulfate d’ammonium Syndrome d’immunodéficience acquise Site de décodage de l’ARNt aminoacylé

SLi SPR TAR TBDMS TBE TCA TEMED Tm TS W

Sulfate de lithium Surface plasmon resonance Transactivating responsive element Tertiobutyldiméthylsilyl Tris-borate-EDTA Acide trichloroacétique N,N,N’,N’-tétraméthylènediamine Température de fusion Thymidilate synthase Atome d’oxygène de la molécule d’eau

La nature représente une succession de miracles.

L’homme ne peut pas l’améliorer ; il ne peut que la modifier.

Peter Benchley