Université Louis Pasteur Strasbourg I

Didier Link

Description

Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
Université Louis Pasteur Strasbourg I 2004 THESE présentée à la FACULTE DES SCIENCES DE LA VIE pour obtenir le titre de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR Domaine : BIOLOGIE MOLECULAIRE ET CELLULAIRE par Didier LINK Étude de la variabilité moléculaire et du pouvoir pathogène d'isolats naturels du virus des nervures jaunes et nécrotiques de la betterave : caractérisation des protéines codées par les ARN-3 et -5 de différents isolats. Soutenue le 13 décembre 2004 devant la Commission d'Examen : Jean-Luc SOUCIET RAPPORTEUR INTERNE Mireille JACQUEMOND RAPPORTEUR EXTERNE Michel RAVELONANDRO RAPPORTEUR EXTERNE Olivier LEMAIRE EXAMINATEUR David GILMER DIRECTEUR DE THESE Institut de Biologie Moléculaire des Plantes (IBMP-CNRS), Strasbourg

• beet soil-borne mosaic


• maladie en milieu naturel


• triphosphate rflp


• trans-lecture dntp


• pcr sds

Sujets

• Lemaire
• Gilmer

Informations

• Publié par: profil-zyak-2012
• Nombre de lectures: 61
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 21 Mo

Extrait

Université Louis Pasteur Strasbourg I 2004

THESE

présentée à la FACULTE DES SCIENCES DE LA VIE

pour obtenir le titre de

DOCTEUR DE L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR Domaine : BIOLOGIE MOLECULAIRE ET CELLULAIRE

par

Didier LINK

Étude de la variabilité moléculaire et du pouvoir pathogène d'isolats naturels du virus des nervures jaunes et nécrotiques de la betterave : caractérisation des protéines codées par les ARN-3 et -5 de différents isolats.

Soutenue le 13 décembre 2004 devant la Commission d'Examen :

Jean-Luc SOUCIET Mireille JACQUEMOND Michel RAVELONANDRO Olivier LEMAIRE David GILMER

RAPPORTEUR INTERNE RAPPORTEUR EXTERNE RAPPORTEUR EXTERNE EXAMINATEUR DIRECTEUR DE THESE

Institut de Biologie Moléculaire des Plantes (IBMP-CNRS), Strasbourg

Abréviations générales

ADN : ADNc : ARN : ARNm : CP-RT : dNTP : ddNTP : GDP : GTP : HR : NES : NLS : ORF : PCR : PTGS : rATP : rCTP : rGTP : rUTP : RFLP : RT-PCR :

Liste des abréviations

Acide désoxyribonucléique ADN complémentaire Acide ribonucléique ARN messager protéine de capside et domaine de trans-lecture désoxyribonucléotides di-désoxyribonucléotides déoxy-guanosine-5'-diphosphate déoxy-guanosine 5'-triphosphate hypersensistive response séquence d'exportation nucléaire séquence d'importation nucléaire cadre ouvert de lecture réaction de polymérisation en chaine post-trnascriptional gene silencing adénosine 5'-triphosphate cytosine 5'-triphosphate guanosine 5'-triphosphate uridine 5'-triphosphate Restriction Fragment Length Polymorphisms transcription inverse suivie d'une PCR SDS-PAGE : gel de polyacrylamide en conditions dénaturante Single-Strand Conformation Polymorphisms ultra-violet uridine 5'-triphosphate

SSCP : UV : UTP :

Abréviations des virus

BNYVV :Beet necrotic yellow vein virus BSBMV :Beet soil-borne mosaic virus BSBV :Beet soil-borne virus BVQ :Beet virus Q CMV :Cucumber mosaic virus E1A :Equine adenovirus 1 HIV-1 :Human immunodeficiency virus type 1 MVM :Minute virus of mice PVX :Potato virus X RSNV :Rice stripe necrosis virus SBWMV :Soilborne wheat mosaic virus SV40 :Simian virus 40 TMGMV :Tobacco mild green mosaic virus TMV ou VMT :Tobacco mosaic virus TYMV :Turnip yellow mosaic virus

1

Table des matières

La rhizomanie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Description de la rhizomanie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Importance économique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Description de l'agent viral : le BNYVV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Classification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Organisation génétique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Transmission naturelle de la maladie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Plantes hôtes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Propagation et contrôle de la maladie en milieu naturel . . . . . . . . . . . Variabilité moléculaire et pathogénicité des isolats viraux . . . . . . . . . . . . . Les différents isolats viraux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Distribution géographique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Importance des différents ARN sur la pathogénicité virale . . . . . . . . . . Présentation du travail . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Épidémiologie et Phylogénie du BNYVV 1.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.1.1 Les différentes méthodes de reconstruction phylogénétique . . . . . 1.1.2 Évaluation des dendrogrammes obtenus . . . . . . . . . . . . . . . 1.1.3 Enracinement d'un dendrogramme . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.1.4 Choix de la meilleure méthode de reconstruction phylogénétique . . 1.2 Échantillonnage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3 Analyse des séquences . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1 1 2 2 2 3 6 7 7 10 10 10 10 11

13 13 14 16 17 17 18 19

III

2

3

1.4

1.5 1.6

Table des matières

Structure des populations virales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.4.1 Étude de la phylogénie de l'ARN-5 . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.4.2 Étude de la phylogénie de l'ARN-2 . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.4.3 Étude de la phylogénie de l'ARN-3 . . . . . . . . . . . . . . . . . Interprétation globale de l'étude phylogénétique . . . . . . . . . . . . . . . Conclusions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

20 21 22 22 23 25

Etude de l'effet de la séquence "tétrade" sur les propriétés biologiques de la protéine P25 29 2.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 2.2 Effet des acides aminés 67 à 70 sur les symptômes foliaires de plantes hôtes 31 2.2.1 Effet surChenopodium quinoa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 2.2.2 Effet surBeta vulgaris32. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.3 Effet surTetragonia expansaetBeta macrocarpa. . . . . . . . . . 33 2.3 Effet de la tétrade sur les propriétés d'activation de transcription de la pro-

2.4

2.5

téine P25 fusionnée au domaine GAL4BD . . . . . . . . . . . . . . . . . . Interaction entre protéines P25 issues de différents isolats et effet de la té- trade sur la dimérisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Conclusions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Influence de l'ARN-5 et de l'expression de la protéine P26 sur les symptômes induits par le BNYVV 3.1 Les voies de transport nucléo-cytoplasmiques dans les cellules eucaryotes . 3.1.1 Le pore nucléaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.2 L'adressage nucléaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.3 Mécanismes de l'import nucléaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.4 Mécanismes de l'export nucléaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.5 Cycle de la protéine RanGTPase et orientation du transport nucléo- cytoplasmique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.6 Régulation du transport nucléo-cytoplasmique . . . . . . . . . . .

35

37 40

42 42 43 45 46 48 49 49

IV

3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9

3.10

Table des matières

3.1.7 Le transport nucléo-cytoplasmique de protéines et acides nu- cléiques viraux : entre activation et inhibition des échanges . . . . . 3.1.8 Inhibition du trafic nucléo-cytoplasmique par les virus qui ont un cycle réplicatif strictement cytoplasmique : exemple du poliovirus . 3.1.9 Le transport nucléo-cytoplasmique chez le BNYVV . . . . . . . . Utilisation de la EGFP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.1 Propriétés de la "Green Fluorescent Protein" (GFP) . . . . . . . . . 3.2.2 Améliorations et modifications des propriétés spectrales de la GFP . 3.2.3 Applications en virologie moléculaire . . . . . . . . . . . . . . . . Etude de la protéine P26 codée par l'ARN-5 . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.1 Effet sur la symptomatologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.2 Construction de clones et de virus recombinants exprimant la pro- téine P26 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Étude du contexte d'initiation de la traduction de la protéine P26 . . . . . . Construction du clone d'ADNc complet et infectieux de l'ARN-5 . . . . .

50 51 52 52 52 53 54 56 56 56 58 60 Construction d'un nouveau vecteur d'expression viral dérivé de l'ARN-5 . 61 62 62 65 68 69 69 70 71 73 74

Localisation sub-cellulaire de la protéine P26 . . . . . . . . . . . . . . . . 3.7.1 Expression de la protéine en contexte viral . . . . . . . . . . . . . 3.7.2 Expression transitoire en cellules BY-2 . . . . . . . . . . . . . . . 3.7.3 Immunolocalisation de la protéine P26 . . . . . . . . . . . . . . . . Recherche de protéines interagissant avec la protéine P26 : utilisation du système double hybride de levure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.8.1 Limites . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.8.2 Recherche d'interactions entre les protéines de capside, la protéine P25 et la protéine P26 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.8.3 Caractérisation du domaine de la protéine P26 responsable de l'ac- tivation de la transcription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Caractérisation des propriétés biologiques de mutants de la protéine P26 . . Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

V