UNIVERSITE LOUIS PASTEUR STRASBOURG I THESE présentée la FACULTE DES SCIENCES DE LA VIE

Laure Schmidlin

Description

Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
UNIVERSITE LOUIS PASTEUR STRASBOURG I 2005 THESE présentée à la FACULTE DES SCIENCES DE LA VIE pour obtenir le titre de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR Discipline : SCIENCES DU VIVANT Spécialité : ASPECTS MOLECULAIRES ET CELLULAIRES DE LA BIOLOGIE par Laure SCHMIDLIN Etude moléculaire des facteurs cellulaires et viraux responsables de la prolifération racinaire observée sur plantes infectées par le virus des nervures jaunes et nécrotiques de la betterave (BNYVV) Soutenue le 29 novembre 2005 devant la Commission d'Examen : Mario KELLER RAPPORTEUR INTERNE Carole CARANTA RAPPORTEUR EXTERNE Martine BOCCARA RAPPORTEUR EXTERNE Guy WEYENS EXAMINATEUR David GILMER DIRECTEUR DE THESE Institut de Biologie Moléculaire des Plantes (IBMP-CNRS) Strasbourg

• description des symptômes de rhizomanie sur la betterave sucrière


• bnyvv


• transmission naturelle du bnyvv par le vecteur polymyxa


• betterave


• viraux responsables de la prolifération racinaire


• faculte des sciences de la vie

Sujets

• Keller
• Vetter
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Informations

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Extrait

UNIVERSITE LOUIS PASTEUR

STRASBOURG I 2005 T H E S E

présentée à la

FACULTE DES SCIENCES DE LA VIE

pour obtenir le titre de

DO CTEU R D E L' U NI VER S ITE LO U IS

P AS TEU R

Discipline : SCIENCES DU VIVANT

Spécialité : ASPECTS MOLECULAIRES ET CELLULAIRES DE LA BIOLOGIE

par

L aureSCHMI DL I N

Etude moléculaire des facteurs cellulaires et viraux responsables de

la prolifération racinaire observée sur plantes infectées par le virus

des nervures jaunes et nécrotiques de la betterave (BNYVV)

Soutenue le 29 novembre 2005 devant la Commission d'Examen :

Mario KELLERRAPPORTEUR INTERNE Carole CARANTARAPPORTEUR EXTERNE Martine BOCCARARAPPORTEUR EXTERNE Guy WEYENSEXAMINATEUR David GILMERDIRECTEUR DE THESE Institut de Biologie Moléculaire des Plantes (IBMP-CNRS) Strasbourg

UNIVERSITE LOUIS PASTEUR

STRASBOURG I 2005 T H E S E

présentée à la

FACULTE DES SCIENCES DE LA VIE

pour obtenir le titre de

DO CTEU R D E L' U NI VER S ITE LO U IS

P AS TEU R

Discipline : SCIENCES DU VIVANT

Spécialité : ASPECTS MOLECULAIRES ET CELLULAIRES DE LA BIOLOGIE

par

L aureSCHMI DL I N

Etude moléculaire des facteurs cellulaires et viraux responsables de

la prolifération racinaire observée sur plantes infectées par le virus

des nervures jaunes et nécrotiques de la betterave (BNYVV)

Soutenue le 29 novembre 2005 devant la Commission d'Examen :

Mario KELLER Carole CARANTA Martine BOCCARA Guy WEYENS David GILMER

RAPPORTEUR INTERNE

RAPPORTEUR EXTERNE

RAPPORTEUR EXTERNE EXAMINATEUR DIRECTEUR DE THESE

Institut de Biologie Moléculaire des Plantes (IBMP-CNRS) Strasbourg

REM ER CI EM EN TS

 Mes remerciements s'adressent tout d'abord à Monsieur le Professeur David Gilmer pour m'avoir accueilli dans son équipe dès mon entrée en DEA, et pour m'avoir énormément guidé et conseillé tout au long de ce travail. Je le remercie tout particulièrement de s'être toujours montré disponible pour la correction de mes multiples rapports, résumés et enfin ma rédaction de thèse. Je le remercie également de m'avoir souvent permis de m'absenter pour suivre de nombreux cours et formations dispensés par l'Ecole Doctorale de l'Université de Strasbourg, ainsi que pour effectuer un bilan de compétences avec l'Association Bernard Grégory. Ceci m'a énormément apporté au point de vue scientifique et personnel, pour mieux appréhender la suite de ma carrière.  Je tiens à remercier évidemment Monsieur le Professeur Mario Keller, ainsi que le Professeur Martine Boccara et le Docteur Carole Caranta, d'avoir bien voulu juger ce travail de thèse.  Je remercie tous les membres de mon équipe (laboratoires 309 et 409) pour leur grande disponibilité, leurs nombreux conseils et leurs encouragements : Véronique Ziegler-Graff, Danièle Scheidecker, Salah Bouzoubaa, Hubert Guilley, Gérard Jonard, Ken Richards du laboratoire 309, Elodie Klein, Didier Link, Audrey Schirmer et Guillaume Vetter de l'équipe 409.  Ce travail de thèse a été possible grâce au financement CIFRE soutenu par la société ADVANTA France devenue par la suite SESVanderHave. Je tiens à remercier Messieurs Marc Lefebvre et Guy Weyens de SESVanderHave Tienen Belgique, pour m'avoir fait confiance depuis le début et pour m'avoir toujours encouragé dans mes recherches. Je les remercie également avec Monsieur Eric De Bruyne, pour m'avoir permis d'effectuer un stage au sein de leur société en juillet 2003 pour compléter mon étude sur les betteraves. Je remercie également Xavier Ballenghien de SESVanderHave France, pour son aide administrative.  Ce travail n'aurait en aucun cas été possible sans l'intervention de nombreuses personnes au sein de l'IBMP : Jérôme Mutterer et Mathieu Erhardt de la plateforme de microscopie, Valérie Cognat pour son aide en bioinformatique, Philippe Hammann et Malek Alioua du service de séquençage, les jardiniers Aurélie Bailly, Richard Wagner, Michel Kernéis, et Sébastien Staerck pour leur attention envers mes nombreuses petites plantes chéries, et enfin Michèle Hadji pour toute cette vaisselle de laboratoire.  Je remercie naturellement les stagiaires qui ont mis généreusement une main à la pâte et qui ont contribué à rendre plus agréable ce travail : Jessica Frongia, Konstantina Katsarou et Gaëlle Mercenne.  Un grand merci à toutes les personnes qui, grâce à leur disponibilité, leur soutien et leur bonne humeur m'ont aidé dans les moments difficiles : Valérie Laval, Rozenn Ménard, Valérie Cognat, Jérôme Mutterer, Mathieu Erhardt, Marc Bergdoll, Gabrielle Haas, Emmanuel Boutant, Esther Lechner et les autres…  Enfin, mes derniers remerciements vont à mes parents et mon compagnon Lionel qui m'ont toujours beaucoup soutenu et surtout énormément encouragé à poursuivre dans cette voie.  Et Maman, tout particulièrement, je ne saurais comment te remercier pour ton énorme soutien tout au long de ce chemin, ta grande force, ton courage malgré les épreuves difficiles de la vie.  A ma petite coccinelle.

SOMMAIR E

SOMMAIRE

LISTE DES ABREVIATIONS

S O M M AIRE

INTRODUCTION GENERALE : LA RHIZOMANIE DE LA BETTERAVE SUCRIERE

1. Transmission naturelle du BNYVV par le vecteurPolymyxa betae 2. Le virus des nervures jaunes et nécrotiques de la betterave ou BNYVV 2.1. Classification 2.2. Structure des particules virales 2.3. Gamme d'hôtes du BNYVV 2.4. Organisation génétique du BNYVV 2.5. Variabilité moléculaire et pathogénicité des isolats viraux 3. Description des symptômes de rhizomanie sur la betterave sucrière 3.1. Symptômes observés en champs 3.2. Caractéristiques histologiques et biochimiques de betteraves rhizomaniées 3.3. Impacts économiques et mesures de contrôle de la maladie 4. Enjeux scientifiques, économique et techniques de la thèse

CHAPITRE I : RECHERCHE DES GENES INDUITS ET REPRIMES DANS LES RACINES DE BETTERAVES INFECTEES PAR LE BNYVV

1. Introduction : les différentes méthodes d'analyses globales du transcriptome 1.1. Le criblage différentiel de banque d'ADNc 1.1.1. Principe 1.1.2. Utilisation 1.2. La méthode "suppression subtractive hybridization" (SSH) 1.2.1. Principe 1.2.2. Utilisation 1.3. La méthode "serial analysis of gene expression" (SAGE) 1.3.1 Principe 1.3.2. Utilisation 1.4. Les puces à ADN 1.4.1. Principe 1.4.2. Utilisation 1.5. La méthode "differential display reverse transcription PCR" (DDRT-PCR) 1.5.1. Principe 1.5.2. Utilisation 1.6. La méthode "cDNA-amplified fragment length polymorphism" 1.6.1. Principe 1.6.2. Utilisation

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1.7. La méthode "restriction fragment differential display PCR" (RFDD-PCR) 2. Analyse comparative partielle entre le transcriptome de racines de betteraves infectées par le BNYVV et celui de betteraves saines 2.1. Reproduction en serre de l'infection naturelle de betteraves par le BNYVV 2.2. Recherche de gènes induits ou réprimés par DDRT-PCR dans les racines de betteraves infectées par le BNYVV 2.3. Recherche de gènes induits ou réprimés par RFDD-PCR dans les racines de betteraves infectées par le BNYVV 3. Vérification de l’expression des gènes candidats identifiés par RFDD-PCR 3.1. Analyse de l’expression différentielle par Northern blot 3.2. Analyse de l'expression différentielle par Northern inverse 4. Mise en évidence des différences d'expression des gènes candidats à un stade très précoce de l'infection virale : utilisation d'un bioessai de betteraves 4.1. Infection standardisée de plantules de betteraves en bioessai 4.2. Analyse de l'expression des gènes candidats par Northern inverse 4.3. Analyse de l'expression de gènes candidats par RT-PCR semi-quantitative 5. Mise en évidence des différences d'expression de gènes candidats au niveau des racines deBeta macrocarpainfectées partiellement par le BNYVV 5.1 Infection systémique précoce de racines deBeta macrocarpa 5.2. Identification de zones saines et virosées sur une même plante 5.3. Analyse de l'expression des gènes candidats par RT-PCR semi-quantitative 5.4. Analyse de l'expression différentielle par Northern inverse 6. Discussion

CHAPITRE II : ETUDE DU ROLE DE LA PROTEINE P25 DU BNYVV DANS LE DEVELOPPEMENT DES SYMPTOMES SUR PLANTES : CARACTERISATION D'ARABIDOPSISEXPRIMANT TRANSGENIQUES CONSTITUTIVEMENT LA PROTEINE P25

1. Introduction : les différentes caractéristiques de la protéine p25 du BNYVV 1.1. Rôle de la protéine p25 dans la symptomatologie foliaire et racinaire 1.2. Transport nucléo-cytoplasmique de la protéine p25 1.3. Régulation de la localisation subcellulaire par phosphorylation 1.4. Propriétés d'activation de la transcription de la protéine p25 2. Expression transitoire de la protéine p25 du BNYVV dans des feuilles de plantes hôtes 3. Expression constitutive de la protéine p25 du BNYVV chezArabidopsis thaliana 3.1. Obtention de lignéesArabidopsistransgéniques exprimant la protéine p25 3.1.1. Sélection de lignées stables d'Arabidopsistransgéniques35S::P25 3.1.2. Confirmation de l'expression stable et ubiquitaire de la protéine p25 3.2. Caractérisation phénotypique desArabidopsistransgéniques35S::P25 3.2.1. Phénotype foliaire et racinaire desArabidopsis35S::P25 3.2.2. Phénotype racinaire desArabidopsisDR5::GFPx35S::P25

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4. Réponse desArabidopsis35S::P25à différentes hormones végétales 4.1. Croissance racinaire en présence de 2,4-D 4.2. Croissance racinaire en présence de MeJA 4.3. Germination et croissance en présence de MeJA, SA, ABA, ACC 5. Mise en évidence des différences d'expression des gènes candidats sous le contrôle transcriptionnel de l'auxine et du jasmonate 5.1. Analyse de l'expression de gènes candidats par RT-PCR semi-quantitative 5.2. Recherche des miRNA contrôlant la voie de signalisation de l'auxine 6. Réponse desArabidopsis35S::P25à l'infection par le BNYVV 7. Analyse globale du transcriptome au niveau des racines d'Arabidopsis35S::P25 7.1. Culture standardisée d'Arabidopsissauvages et transgéniques35S::P25 7.2. Analyse du trancriptome par "cDNA-microarray" (CATMA) 7.2.1. Méthode d’analyse comparative utilisée 7.2.2. Identification de gènes dérégulés dans les trois lignées35S::P25 7.2.3. Identification de gènes dérégulés dans la lignée35::P25B: analyse globale préliminaire 7.2.3.1. Signalisation de l'auxine 7.2.3.2. Transduction de signal et facteurs de transcription 7.2.3.3. Protéines de stress de type HSC/HSP, péroxydases et oxydoréductases 7.2.3.4. Voie de l’apoptose 7.2.3.5. Autres candidats 8. Discussion

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES

MATERIEL ET METHODES

1. Matériel végétal, méthodes de culture et d'infection 1.1. Matériel végétal 1.1.1. Les plantes hôtes du BNYVV 1.1.1.1. La betterave sucrière (Beta vulgaris) 1.1.1.2. La betterave sauvage (Beta macrocarpa) 1.1.1.3.Chenopodium quinoa 1.1.1.4. La tétragone (Tetragonia expansa) 1.1.2. L'arabette (Arabidopsis thaliana) écotype Columbia (Col-0) 1.1.2.1. Culturein vitrod'Arabidopsis thaliana 1.1.2.2. Culture d'Arabidopsis thalianaen terre 1.2. Infection virale, agroinfiltration et transformation des plantes 1.2.1. Multiplication du BNYVV surChenopodium quinoa 1.2.1.1. Synthèse d'ARN infectieux du BNYVV par transcriptionin vitro 1.2.1.2. Obtention des isolats artificiels du BNYVV 1.2.2. Infection systémique deBeta macrocarpapar le BNYVV 1.2.3. Infection naturelle de racines deBeta vulgarispar le BNYVV 1.2.4. Infiltration de bactériesAgrobacterium dans les feuilles de betteraves (Voinnetet al., 1998)

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1.2.5. Transformation d'Arabidopsis thaliana"floral dip" (Clough par and Bent, 1998) 2. Souches bactériennes et vecteurs de clonage 2.1. Souches bactériennes et milieux de culture 2.1.1.Escherichia colide souche XL1 Blue 2.1.2.Agrobacterium tumefaciensde souche GV3101 2.2. Vecteurs de clonage 2.2.1. Le plasmide pGEM®-T 2.2.2. Le plasmide pBin 61 (Voinnetet al., 2000) 3. Analyse des ARN 3.1. Extraction et purification d'ARN totaux de plantes 3.1.1. Extraction d'ARN totaux par RNeasy® Plant Mini Kit (QIAGEN®) TM 3.1.2. Extraction d'ARN totaux par TRIZOL® Reagent (Invitrogen ) (Chomezynski and Sacchi, 1987) 3.1.3. Extraction d'ARN totaux par PURESCRIPT RNA Isolation Kit (GENTRA Systems) 3.1.4. Extraction d'ARN totaux dans le tampon "polysomes" (Jackson and Larkins, 1976) 3.1.5. Purification des ARN messagers par NucleoTrap® mRNA Mini Kit (Macherey-Nagel) 3.2. Analyse des ARN par RT-PCR 3.2.1. Transcription inverse des ARNm 3.2.2. Amplification des ADNc par PCR 3.2.3. Conditions de RT-PCR semi-quantitative 3.3. Analyse des ARNm par "differential display reverse transcription PCR" (DDRT-PCR) 3.3.1. Transcription inverse des ARNm 3.3.2. Amplification par PCR de l'extrémité 5’ des ADNc 3.3.3. Séparation des produits PCR sur gel de polyacrylamide dénaturant 3.3.4. Isolement, réamplification et purification des ADNc d’intérêt 3.4. Analyse globale des ARNm par "restriction fragment differential display PCR" (RFDD-PCR) 3.4.1. Synthèse et préparation des ADNc 3.4.1.1. Transcription inverse des ARNm et synthèse d'ADN double brin 3.4.1.2. Fragmentation des ADNc et ligation d'adaptateurs 3.4.2. Préparation des amorces radiomarquées par phosphorylation de l'extrémité 5' 3.4.3. Amplification des ADNc par PCR radioactive sélective 3.4.4. Séparation des produits PCR sur gel de polyacrylamide dénaturant 3.4.5. Isolement, réamplification et purification des ADNc d’intérêt 3.5. Clonage et séquençage des ADNc d’intérêt 3.5.1. Phosphorylation des produits PCR 3.5.2. Purification d'ADN par électrophorèse en gel d'agarose LMP 3.5.3. Ligation des ADNc dans le vecteur pGEM®-T 3.5.4. Transformation bactérienne par la technique d’électroporation 3.5.5. Préparation d’ADN plasmidique (mini-préparation) 3.5.6. Analyse de l’ADN plasmique par séquençage automatique

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3.5.7. Analyses bioinformatiques 3.6. Analyse des ARN par Northern blot 3.6.1. Séparation des ARN sur gel d’agarose et transfert sur membrane 3.6.2. Synthèse des sondes ribonucléiques 3.6.3. Visualisation des ARN viraux par hybridation moléculaire 3.6.4. Visualisation des ARNm par hybridation moléculaire 3.7. Analyse de l'expression de séquences d'intérêt par Northern inverse 3.7.1. Migration des produits PCR sur gel d'agarose et transfert sur membrane 3.7.2. Préparation des ADNc radiomarqués 3.7.3. Révélation des différences d'expression par hybridation moléculaire 3.8. Analyse des siRNA et miRNA (Hamilton and Baulcombe, 1999) 3.8.1. Séparation des ARN sur gel de polyacrylamide dénaturant et transfert sur membrane 3.8.2. Préparation d’une sonde ADN spécifique des siRNA 3.8.3. Préparation d'une sonde ADN spécifique des miRNA 3.8.4. Détection de siRNA ou miRNA par hybridation moléculaire 4. Analyse de l'ADN génomique 4.1. Extraction d'ADN génomique de feuilles d'Arabidopsis thaliana 4.2. Analyse de l’ADN génomique par Southern blot (Southern, 1975) 4.2.1. Digestion de l’ADN génomique et purification 4.2.2. Séparation des fragments d’ADN sur gel d'agarose dénaturant et transfert sur membrane 4.2.3. Détection de fragments ADN par hybridation moléculaire 4.3. Caractérisation du site d'insertion du T-DNA dans les lignées transgéniques d'Arabidopsis thaliana 4.3.1. Digestion de l’ADN génomique et purification 4.3.2. Ligation intramoléculaire des fragments de restriction 4.3.3. Amplification par PCR inverse, purification et séquençage 5. Analyse des protéines 5.1. Analyse des protéines par la technique du Western blot 5.1.1. Extraction des protéines totales de plantes 5.1.2. Fractionnement des protéines par électrophorèse en gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) 5.1.3. Immunodétection des protéines par la technique du Western blot 5.2. Immuno-empreintes de racines de betteraves 5.3. Immunomarquage de protéines virales et observation par microscopie électronique 5.3.1. Préparation des échantillons 5.3.2. Immunomarquage à l'or colloïdal sur des coupes ultra-fines 5.3.3. Observation des coupes

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ANNEXES

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LISTEDES AB R EVIA T IONS