Actividad inmunomoduladora del extracto de metanol de la cabeza floral de Sphaeranthus indicus Linn (Immunomodulatory activity of methanol extract of flower-heads of Sphaeranthus indicus Linn)

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Resumen
El extracto de metanol y sus fracciones de éter de petróleo, cloroformo y metanol sobrante de las cabezas florales de Sphaeranthus indicus Linn demostraron su eficacia al aumentar la actividad fagocítica, el título de anticuerpos de la hemaglutinación y la hipersensibilidad de tipo retardado, mientras que sólo la fracción de metanol restante resultó activa en la normalización de los niveles de leucocitos totales en el caso de la mielosupresión inducida por ciclofosfamida en ratones. Por tanto, el presente estudio revela que el fármaco augura buenos resultados como agente inmunomodulador, al actuar como estimulante de la inmunidad celular y humoral y de la función fagocítica.
Abstract
Methanol extract, its petroleum ether, chloroform and remaining methanol fractions, of flower heads of Sphaeranthus indicus Linn. were found effective in increasing phagocytic activity, haemagglutination antibody titer and delayed type hypersensitivity, whereas only remaining methanol fraction was found active in normalizing total WBC levels in case of cyclophosphamide induced myelosuppression in mice. Present study, therefore, reveals that the drug holds promise as immunomodulatory agent, which acts by stimulating both humoral as well as cellular immunity and phagocytic function.
Publié le : jeudi 1 janvier 2004
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Source : Ars Pharmaceutica 0004-2927 2004 Volumen 45 Número 3
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ACTIVIDAD INMUNOMODULADORA DEL EXTRACTO DE METANOL DE LA CABEZA FLORAL... 281
Actividad inmunomoduladora del extracto
de metanol de la cabeza floral de Sphaeranthus
indicus Linn
Immunomodulatory activity of methanol extract of flower-heads of
Sphaeranthus indicus Linn
BAFNA AR, AND MISHRA SH.*
Pharmacy Department, Faculty of Technology and Engineering,
The M.S.University of Baroda,Vadodara-390002,Gujarat, India
*Dirección para correspondencia: Dr.S.H.Mishra, Pharmacy department, Faculty of Technology and Engineering,
The M.S.University of Baroda, Vadodara-390002. Gujarat, India.
Correo electrónico:shmishra48@rediffmail.com
RESUMEN
El extracto de metanol y sus fracciones de éter de petróleo, cloroformo y metanol sobrante de las cabezas florales
de Sphaeranthus indicus Linn demostraron su eficacia al aumentar la actividad fagocítica, el título de anticuerpos
de la hemaglutinación y la hipersensibilidad de tipo retardado, mientras que sólo la fracción de metanol restante
resultó activa en la normalización de los niveles de leucocitos totales en el caso de la mielosupresión inducida por
ciclofosfamida en ratones. Por tanto, el presente estudio revela que el fármaco augura buenos resultados como agente
inmunomodulador, al actuar como estimulante de la inmunidad celular y humoral y de la función fagocítica.
PALABRAS CLAVE: Sphaeranthus indicus. Actividad inmunomoduladora. Hemaglutinación. Mielosupresión.
ABSTRACT
Methanol extract, its petroleum ether, chloroform and remaining methanol fractions, of flower heads of Sphaeranthus
indicus Linn. were found effective in increasing phagocytic activity, haemagglutination antibody titer and delayed type
hypersensitivity, whereas only remaining methanol fraction was found active in normalizing total WBC levels in case
of cyclophosphamide induced myelosuppression in mice. Present study, therefore, reveals that the drug holds promise
as immunomodulatory agent, which acts by stimulating both humoral as well as cellular immunity and phagocytic
function.
KEY WORDS: Sphaeranthus indicus. Immunomodulatory activity. Haemagglutination. Myelosuppression.
INTRODUCCIÓN INTRODUCTION
Los fármacos herbales son conocidos por sus Herbal drugs are known to possess immuno-
propiedades inmunomoduladoras y por estimu- modulatory properties and generally act by sti-
lar de forma generalizada la inmunidad específi- mulating both specific and non-specific immuni-
1 1ca y no específica . Muchas de las plantas utili- ty . Many plants used in traditional medicine are
zadas en la medicina tradicional han demostrado reported to have immunomodulating activities.
poseer actividades inmunomoduladoras. Algunas Some of these stimulate both humoral and cell
de estas plantas estimulan tanto la inmunidad mediated immunity while others activate only
celular como la inmunidad humoral, mientras que the cellular components of the immune system,
otras sólo activan los componentes celulares del i.e. phagocytic function without affecting the
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sistema inmunitario, es decir, la función fagocí- humoral or cell mediated immunity. Leaf extract
tica sin afectar a la inmunidad celular o humo- of Picrorrhiza kurroa stimulated the humoral
ral. El extracto de hoja de Picrorhiza kurroa actúa response and the phagocytic function of the re-
como estimulante de la respuesta humoral y de ticuloendothelial system. Some of these plants
la función fagocítica del sistema reticuloendote- also suppress both humoral and cell mediated
2,3lial. Algunas de estas plantas también actúan como immunity .
2,3supresores de la inmunidad celular y humoral . About 34 plants are identified as rasayanas
Aproximadamente unas 34 plantas se identi- in Indian Ayurvedic system of medicine having
various pharmacological properties such as im-fican como rasayanas en el sistema de medicina
Ayurvedic de la India y presentan diversas pro- munostimulant, tonic, neurostimulant, antiageing,
piedades farmacológicas inmunoestimulantes, antibacterial, antiviral, antirheumatic, anticancer,
4tónicas, neuroestimulantes, anti-envejecimiento, adaptogenic, antistress etc. . An entire section of
antibacterianas, antivirales, antireumáticas, anti- materia medica of Ayurveda is devoted to drugs
4 Lacancerígenas, adaptogénicas, antiestrés, etc. entitled as ‘Rasayana’ used for enhancement of
5materia médica ayurvédica dedica una sección body resistance . Many plants with potential
completa a los fármacos utilizados para mejorar immunomodulatory activity are reported, some
la resistencia corporal titulada ‘Rasayana’. Se of these have already been undertaken for eva-
identificaron diversas plantas con actividad in- luation of their activities in animals, and also to
munomoduladora potencial, entre las que se en- some extent in humans. Some glaring examples
contraban algunas con las que ya se había em- with promising activity are Asparagus racemo-
prendido la evaluación de sus actividades en sus, Azadirachta indica, Curcuma longa, Oci-
animales y, en cierta medida, en humanos. Aspa- mum sanctum, Panax ginseng, Picrorrhiza ku-
ragus racemosus, Azadirachta indica, Curcuma rroa, Tinospora cordifolia, Withania somnifera
longa, Ocimum sanctum, Panax ginseng, Picro- etc. A lot more are still to be explored and offer
4rrhiza kurroa, Tinospora cordifolia, Withania scope for further investigation .
somnifera etc. son algunos ejemplos evidentes Sphaeranthus indicus Linn. (Compositae) is a
de plantas con una actividad prometedora. Aún herb found mostly in southern part of India used
quedan por investigar muchas más, lo que am- as bitter stomachic, stimulant, alterative, pecto-
plía las posibilidades para futuras investigacio- ral and demulcent, and externally emollient.
4nes . Distilled water prepared like rose water from the
Sphaeranthus indicus Linn. (Compositae) es herb is recommended by local physicians for
una hierba que se encuentra principalmente en el bilious affections and for dispersions of various
sur de la India que posee propiedades antiulce- kinds of tumours. Flowers (flower heads) are
rosas, estomacales, estimulantes, curativas, pec- highly esteemed as alteratives, depuratives, re-
torales, demulcentes y emolientes de forma ex- frigerants and tonics, useful as blood purifiers in
terna. Los médicos locales recomiendan el agua skin diseases. The drug is also useful in urethral
6destilada preparada como el agua de rosas pro- discharges and in jaundice . The present investi-
cedente de la hierba para las afecciones biliares gation was aimed to study the immunomodula-
y la diseminación de varios tipos de tumores. tory activity of methanol extract of flower heads
Las flores (la cabeza floral) son muy apreciadas of S.indicus and its different fractions using re-
por sus propiedades curativas, depurativas, fe- ported methods in order to justify the traditional
brífugas y tónicas, muy útiles como purificado- claims endowed upon the drug as rasayana.
ras de la sangre en patologías dérmicas. El fár-
maco es también muy útil para combatir la ictericia
y las secreciones uretrales. La presente investi- MATERIALS AND METHODS
gación se realizó con el propósito de estudiar la
actividad inmunomoduladora del extracto de Animals: Swiss albino mice of either sex,
metanol de las cabezas florales de S.indicus y weighing 20-25 gms, household in standard con-
sus distintas fracciones mediante los métodos ditions of temperature, humidity and light were
establecidos para justificar las indicaciones tradi- used. They were fed with standard rodent diet
cionales legadas por el fármaco como rasayana. and water ad libitum.
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MATERIALES Y MÉTODOS Plant material and extract preparation: Fresh
flower heads of S.indicus were collected from
Animales: Ratones albinos suizos de ambos the outfield of city, and were authenticated in
Botany Department of M.S.University, Baroda.sexos, con un peso de entre 20 y 25 g., mante-
Maceration of air-dried, powdered flower headsnidos en condiciones estándar de temperatura,
of S.indicus afforded 6.65% methanol extract (w/humedad y luz. Fueron alimentados con una die-
w). Methanol extract so obtained was then frac-ta estándar de roedor y agua ad libitum.
tionated by maceration into different polarity
solvents like petroleum ether, benzene, chloro-Material de la planta y preparación del
form and methanol. All respective fractions wereextracto: Se recogieron cabezas florales frescas
concentrated under vacuum and used for phyto-de S.indicus procedentes de los jardines de la
chemical and pharmacological screening. Methanolciudad y se autenticaron en el Departamento de
extract gave positive tests for alkaloids, pheno-botánica de la M.S.University, Baroda. La ma-
ceración de las cabezas florales disecadas al aire lics, steroids, terpenoids and carbohydrates. Pe-
troleum ether, benzene and chloroform fractionsde S.indicus proporcionó un 6,65% de extracto
gave positive tests for terpenoids and steroidsde metanol (w/w). El extracto de metanol obte-
whereas methanol fraction gave positive tests fornido de este modo se fraccionó por maceración
alkaloids, phenolics and carbohydrates on phyto-en disolventes de distintas polaridades como el
7.éter de petróleo, el benceno, el cloroformo y el chemical screening
metanol. Todas sus respectivas fracciones se
Test samples: Weighed quantities of testconcentraron al vacío y se utilizaron para el cri-
extracts were suspended in 1% sodium carboxybado farmacológico y fitoquímico. El extracto
methylcellulose to prepare suitable dosage form.de metanol resultó positivo en las pruebas de
The control animals were given an equivalentalcaloides, felónicos, esteroides, terpenoides y
volume of sodium carboxy methylcellulose ve-carbohidratos. Las fracciones de cloroformo,
hicle. Cyclophosphamide was used as a standardbenceno y éter de petróleo resultaron positivas
immunosuppressant.en las pruebas de terpenoides y esteroides, mien-
Carbon ink suspension: Pelican AG, Germany,tras que la fracción de metanol resultó positiva
ink was diluted eight times with saline and useden las pruebas de alcaloides, felónicos y carbo-
7 for carbon clearance test in a dose of 10µl/gmhidratos en el cribado fitoquímico .
body weight of mice.
Sheep red blood cells (SRBCs) were washed Muestras de prueba: Las cantidades pesa-
das de los extractos de prueba se suspendieron with three times in normal saline and adjusted to
a concentration 20% for immunization and 1%en un 1% de carboximetilcelulosa de sodio para
for challenge as Antigen.preparar las formas de dosificación adecuadas.
A los animales controlados se les proporcionó
un volumen equivalente de carboximetilcelulosa
de sodio como vehículo. La ciclofosfamida se METHODS
utilizó como inmunosupresor estándar.
Suspensión de tinta de carbón: Se diluyó tinta Phagocytic activity
Pelican AG, Germany ocho veces con solución
salina y se utilizó para la prueba de depuración Phagocytic index was determined as per the
8del carbón en una dosis de 10µl/gm de peso method reported by Gonda et al. Mice were
corporal de los ratones. divided into 11 groups, of six animals each. The
Los eritrocitos de cordero se lavaron tres veces control group received 1.0 % sodium carboxy
en solución salina normal y se ajustaron a una methylcellulose solution only as vehicle; while
concentración del 20% para la inmunización y animals of the treatment groups were given test
del 1% para la prueba como antígeno. extracts (100 and 200 mg/kg, p.o.) in 1.0 % sodium
carboxy methyl cellulose daily for 5 days. Car-
bon ink suspension was injected via tail vein to
each mouse after 48 hours of 5 days treatment.
Blood samples were drawn from orbital vein at
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MÉTODOS 0 and 15min. Blood (25-µl) was mixed with 0.1
% sodium carbonate (2 ml) and subjected for
Actividad fagocítica determination optical densities at 660 nm.
The phagocytic index K, was calculated by
using following equation:El índice fagocítico se determinó mediante el
8 K= (In OD -In OD ) / (t -t )método establecido por Gonda et al. Los rato- 1 2 2 1
where OD and OD are the optical densitiesnes se dividieron en 11 grupos con seis animales 1 2
and t , respectively.at times tcada uno. El grupo de control sólo recibió un 1 2
1,0% de solución de carboximetilcelulosa de sodio
como vehículo, mientras que a los animales de
Cyclophosphamide induced Myelosuppressionlos grupos de tratamiento se les administraron
los extractos de prueba (100 y 200 mg/kg, vía
Cyclophosphamide induced myelosuppressionoral) en un 1,0% de caborximetilcelulosa de sodio
was studied according to the method describeddiariamente durante 5 días. A cada ratón se le
9by Manjarekar et al. Animals were divided intoinyectó la suspensión de tinta de carbón a través
12 groups of six animals each. The control groupde la vena de la cola 48 horas después del tra-
and cyclophosphamide group received 1.0 %tamiento de 5 días. Se extrajeron muestras de
sodium carboxy methylcellulose solution only assangre de la vena orbital a los 0 y 15 minutos.
vehicle daily for 13 days while animals in treat-La sangre (25-µl) se mezcló con un 0,1% de
ment groups were given the test extracts (100carbonato sódico (2 ml) y se sometió a la deter-
and 200 mg/kg, p.o.) in 1.0 % sodium carboxyminación de densidades ópticas a 660 nm.
methyl cellulose daily for 13 days. On days 11,El índice fagocítico (K) se calculó mediante
12, 13 all the animals except in the control groupla siguiente ecuación:
were injected with cyclophosphamide (30mg/kg,K= (In OD -In OD ) / (t -t )1 2 2 1
i.p.) 1 hour after administration of the extracts.donde OD y OD son las densidades ópticas1 2
Blood samples were collected on day 14 and totalen los momentos t and t , respectivamente.
1 2
white blood cell (WBC) count was determined.
Mielosupresión inducida por ciclofosfamida
Humoral antibody (HA) titre and delayed type
hypersensitivity (DTH) response:La mielosupresión inducida por ciclofosfami-
da se estudió de acuerdo con el método descrito
10 9 The method described by Puri et al. waspor Manjarekar et al. Los animales se dividie-
adopted. Animals were divided into 11 groupsron en 12 grupos de seis animales cada uno. El
of six animals each. The control group receivedgrupo de control y el grupo de la ciclofosfamida
1.0 % sodium carboxy methylcellulose solutionrecibieron un 1,0% de solución de carboximetil-
celulosa de sodio sólo como vehículo diariamen- only as vehicle; while animals in the treatment
groups were given the test extracts (100 and 200te durante 13 días, mientras que a los animales
mg/kg, p.o.) in 1.0 % sodium carboxy methylde los grupos de tratamiento se les administra-
cellulose daily for 7 days. The animals wereron los extractos de prueba (100 y 200 mg/kg,
immunized by injecting 0.1 ml of 20% of freshvía oral) en un 1,0% de caborximetilcelulosa de
sodio diariamente durante 13 días. Los días 11, sheep red blood cells suspension intraperitonea-
lly on 0 day. Blood samples were collected in12 y 13, a todos los animales excepto a los del
micro centrifuge tubes from individual animalgrupo de control se les inyectó ciclofosfamida
thby retro-orbital plexus on 7 day to obtain serum.(30 mg/kg, intraperitoneal) 1 hora después de la
Antibody levels were determined by haemagglu-administración de los extractos. Las muestras de
sangre se extrajeron el día 14 y se determinó el tination technique. Briefly, equal volumes of
individual serum samples of each group wererecuento de leucocitos totales.
pooled. Two fold dilutions of pooled serum sam-
ples were made in 25 µl volumes of normal sa-
line in microtitration plate and to it added 25 µl
of 1% suspension of sheep red blood cells in
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Título de anticuerpos humorales y la respuesta saline. After mixing, the plates were incubated
de la hipersensibilidad de tipo retardado (DTH): at room temperature for 1 hr. and examined for
haemagglutination under microscope. The reci-
10Se adoptó el método descrito por Puri et al. procal of the highest dilution of the test serum
Los animales se dividieron en 11 grupos de seis giving agglutination was taken as the antibody
animales cada uno. El grupo de control recibió titre.
thun 1,0% de solución de carboximetilcelulosa de On 7 day, the thickness of the right hind
sodio sólo como vehículo, mientras que a los footpad was measured using digital vernier cali-
animales de los grupos de tratamiento se les per. The mice were then challenged by injection
of 20µl of 1% SRBCs in right hind footpad. Footadministraron los extractos de prueba (100 y 200
mg/kg, vía oral) en un 1,0% de caborximetilce- thickness was again measured after 24 hrs of
lulosa de sodio diariamente durante 7 días. El this challenge. The difference between the pre
día 0, los animales fueron inmunizados median- and post challenge foot thickness express in mm
te la inyección intraperitoneal de 0,1 ml de sus- was taken as a measure of delayed type hyper-
sensitivity (DTH).pensión fresca de eritrocitos de cordero al 20%.
Las muestras de sangre se extrajeron en tubos
microcentrífugos a cada animal de forma indivi-
dual del plexo retroorbital el día 7 para la obten- Statistical analysis
ción de suero. Los niveles de anticuerpos se
determinaron mediante la técnica de hemagluti- Data are expressed as the mean ± S.E.M. and
nación. En síntesis, se obtuvo el mismo volumen statistical analysis was carried out employing
de suero de las muestras individuales de cada Student’s t-test.
grupo. Las diluciones de factor dos de las mues-
tras de suero mezclado se realizaron en volúme-
nes de 25 µl de solución salina normal en placas RESULTS
de microtítulo y a las que se añadieron 25 µl de
suspensión de eritrocitos de cordero en solución Carbon clearance test
salina al 1%.
Una vez realizada la mezcla, las placas se Methanol extract of S.indicus and its fractio-
incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora ns in different solvents possess macrophage sti-
y se examinaron bajo el microscopio en busca mulatory activity as evidenced by increased pha-
de hemaglutinación. Se tomó como título de gocytic index in carbon clearance test. The
anticuerpos la muestra recíproca de la dilución phagocytic activity of reticuloendothelial is ge-
más alta de los sueros de prueba que resultó nerally measured by the rate of removal of car-
positiva en aglutinación. El día 7, se midió el bon particles from blood stream. The phagocytic
grosor de la pata trasera derecha mediante el index for control group was found to be 0.094 ±
calibrador digital Vernier. A continuación, se 0.0065 whereas all test extracts of S.indicus in-
inyectó a los ratones 20µl de eritrocitos de cor- creased it significantly. The maximum effect was
dero al 1% en la pata trasera derecha. Se midió found in case of methanol extract and its petro-
de nuevo el grosor de la pata pasadas 24 horas. leum ether and remaining methanol fractions
La diferencia entre el grosor de la pata antes y (P<0.001) (Table 1).
después de la inyección expresada en mm se tomó
como medida de hipersensibilidad de tipo retar-
dado (DTH).
Análisis estadístico
Los datos se expresaron como la media ± del
análisis S.E.M. y el análisis estadístico se reali-
zó con el empleo de pruebas t de estudiantes.
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RESULTADOS
Prueba de depuración del carbón
El extracto de metanol de S.indicus y sus frac-
ciones en distintos disolventes poseen actividad
estimuladora macrófaga como demostró el au-
mento del índice fagocítico en la prueba de de-
puración del carbón. La actividad fagocítica del
sistema reticuloendotelial generalmente se mi-
dió en relación con la velocidad de eliminación
de las partículas de carbón del flujo sanguíneo.
El índice fagocítico del grupo de control fue de
0,094 ± 0,0065, mientras que en todos los ex-
tractos de prueba de S.indicus aumentó de forma
significativa. El máximo efecto se encontró en
el caso del extracto de metanol y la fracción de
éter de petróleo y la fracción de metanol sobran-
te (P<0,001) (Tabla 1).
TABLA I: Efecto del extracto de metanol y sus distintas fracciones cromatográficas sobre el título de anticueros
humorales, la respuesta DTH, el índice fagocítico y la mielosupresión inducida por ciclofosfamida.
TABLE I: Effect of methanol extract and its different Fractions on HA titre, DTH response,
phagocytic index and cyclophosphamide induced myelosuppression.
Título de anticuerpos Respuesta DTH (mm) Índice fagocítico Recuento de leucocitos totales
Dosis humorales Media edema de la pata ±
Tratamiento Media ± análisis S.E.M. Media ± análisis S.E.M.
Dose Media ± análisis S.E.M. análisis S.E.M.
Treatment Phagocytic index Total WBC count
mg/kg HA titre DTH response (mm)
Mean ± S.E.M. Mean ± S.E.M.
Mean ± S.E.M. Mean paw edema ± S.E.M.
Control - 64,00 ± 14,311 0,313 ± 0,038 0,0943±0,006 5800±99,16
Ciclofosfamida
30 - - - 2142±248,1 Cyclophosphamide
c c c cExtracto de metanol 100 682,7±107,9 0,590 ± 0,054 0,150±0,008 4191±214,6
c c c cMethanol extract 200 405,3±69,46 0,576 ± 0,084 0,126±0,005 4300±1544
c c c bFracción de éter de petróleo 100 256,0±57,24 0,470 ± 0,050 0,151±0,005 3483±222,4
Petroleum ether fraction
c c c c200 298,7±71,39 0,510 ± 0,037 0,167±0,004 3625±197,8
d N.S. c dFracción de benceno 100 170,7±75,12 0,275 ± 0,033 0,125±0,002 2650±172,7
a N.S. c aBenzene fraction 200 138,7±25,69 0,246 ± 0,062 0,123±0,005 3058±157,3
a c c a100 277,3±76,92 0,521 ± 0,022 0,123±0,003 2868±101,4 Fracción de cloroformo
a N.S. c aChloroform fraction 200 160,0±32,00 0,332 ± 0,059 0,139±0,005 3100±96,61
c c c cFracción de metanol 100 341,3±78,67 0,670 ± 0,050 0,165±0,004 5275±453,1
c c c cMethanol fraction 200 426,7±53,97 0,810 ± 0,037 0,162±0,004 6083±568,9
Los valores se expresan como la media ± del análisis S.E.M. n=6; a = p<0,05, b = p<0,001, d = N.S. (No significativo).
Todos los grupos de tratamiento se compararon con el grupo de control para el título de anticuerpos humorales, la respuesta DTH y el
índice fagocítico, y se compararon con el grupo de la ciclofosfamida en el caso de la mielosupresión inducida por la ciclofosfamida.
Values are expressed as mean ± S.E.M. n=6; a = p<0,05, b = p<0,001, d = N.S. (Non Significant).
All treated groups are compared with control for HA titre, DTH response and phagocytic index, whereas with cyclophosphamide group
in case of cyclophosphamide induced myelosuppression.
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Mielosupresión inducida por ciclofosfamida Cyclophosphamide induced myelosuppression
La administración de ciclofosfamida provocó Administration of cyclophosphamide has sig-
nificantly lowered the levels of total WBC (2142el descenso significativo de los niveles de leuco-
citos totales en sangre (2142 ± 248,08) en com- ± 248.08) as compared to control group (5800 ±
paración con el grupo de control (5800 ± 99,16). 99.16) in blood. Methanol extract and remaining
El extracto de metanol y la fracción de metanol methanol fraction were found potent in protec-
sobrante resultaron ser unos potentes protectores ting cyclophosphamide-induced myelosuppression
as evidenced by increasing the levels of totalde la mielosupresión inducida por ciclofosfami-
da como evidenció el aumento significativo de WBC count significantly (p< 0.001). Petroleum
los niveles del recuento de leucocitos totales (p< ether and chloroform fraction also raised WBC
0,001). Las fracciones de éter de petróleo y clo- levels but could not reach up to the normal va-
roformo también aumentaron los niveles de leu- lues. Remaining methanol fraction of methanol
cocitos pero no pudieron alcanzar los valores extract was the only fraction that increased the
normales. La fracción de metanol sobrante del total WBC count up to the normal values in a
extracto de metanol fue la única fracción que dose dependent manner (5275 ± 453.1 and 6083
aumentó el recuento de leucocitos totales hasta ± 568.9 at 100 and 200 mg/kg respectively).
valores normales de una forma dosis-dependien-
te (5275 ± 453,1 y 6083 ± 568,9 para 100 y 200
mg/kg respectivamente). Humoral antibody (HA) titre and delayed type
hypersensitivity (DTH) response
Título de anticuerpos humorales y la respuesta Humoral response to SRBCs was checked by
de la hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) haemagglutination antibody titre. The humoral
antibody titre value in control was found to be
La respuesta humoral ante los eritrocitos de 64.00 ± 14.31. Administration of methanol ex-
cordero se comprobó mediante el título de anti- tract and its fractions produced increase in hu-
cuerpos de la hemaglutinación. El valor del títu- moral antibody titre as evident by haemaggluti-
lo de anticuerpos humorales del grupo de con- nation at that dilution. Statistically significant
trol fue 64,00 ± 14,31. La administración del levels were obtained with methanol extract and
extracto de metanol y sus fracciones produjo un its petroleum ether, chloroform and remaining
aumento del título de anticuerpos humorales como methanol fraction at both the dose level. The
evidenció la hemaglutinación en esta dilución. dose dependent increase was established only with
petroleum ether (256 ± 57.24 and 298.7 ± 71.39)Se obtuvieron niveles estadísticamente signifi-
cativos con el extracto de metanol y sus fraccio- and methanol fraction (341.3 ± 78.67 and 426.7
nes de éter de petróleo, cloroformo y metanol ± 53.97). Methanol extract (682.7 ± 107.9 and
sobrante en ambas dosis. El aumento dosis-de- 405.3 ± 69.46) and chloroform fraction (277.3 ±
pendiente sólo se estableció con la fracción de 76.92 and 160 ± 32) showed decrease in levels
at higher dose.éter de petróleo (256 ± 57,24 y 298,7 ± 71,39)
y la fracción de metanol (341,3 ± 78,67 y 426,7 DTH response was checked by increased foo-
± 53,97). El extracto de metanol (682,7 ± 107,9 tpad thickness using digital vernier calipers.
y 405,3 ± 69,46) y la fracción de cloroformo Administration of methanol extract and its frac-
(277,3 ± 76,92 y 160 ± 32) mostraron un des- tions produced increase in thickness of footpad
of mice as a measure of DTH response. Statisti-censo de los niveles a dosis más altas.
La respuesta DTH se comprobó por el au- cally significant (p<0.001) increase in DTH res-
mento del grosor de la pata mediante el calibra- ponse in dose dependent manner by remaining
dor digital Vernier. La administración del ex- methanol fraction (0.670 ± 0.050 and 0.810 ±
tracto de metanol y sus fracciones produjo un 0.037) and petroleum ether fraction (0.470 ± 0.050
aumento del grosor de la pata de los ratones, and 0.510 ± 0.037) obtained. Benzene fraction
hecho que se tomó como medida de la respuesta slightly reduced the DTH response by reducing
DTH. Se obtuvo un aumento estadísticamente thickness of footpad compared to control group.
significativo (p<0,001) de la respuesta DTH en Methanol extract and chloroform fraction also
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la forma dosis-dependiente con la fracción de showed increased DTH response compared to
metanol sobrante (0,670 ± 0,050 y 0,810 ± 0,037) control group.
y la fracción de éter de petróleo (0,470 ± 0,050
y 0,510 ± 0,037). La fracción de benceno redujo
levemente la respuesta DTH al reducir el grosor DISCUSSION
de la pata en comparación con el grupo de con-
trol. El extracto de metanol y la fracción de clo- Immunomodulatory activity of S.indicus was
roformo también mostraron un aumento de la explored, by evaluating its effect on antibody
respuesta DTH en comparación con el grupo de titre, DTH response, phagocytic function and
control. cyclophosphamide induced myelosuppression in
mice. Administration of methanol extract and its
fractions showed immunostimulating activity.
DISCUSIÓN Significant stimulation with respect to these pa-
rameters was obtained with methanol extract, its
Se estudió la actividad inmunomoduladora de petroleum ether and remaining methanol frac-
S.indicus mediante la evaluación de su efecto en tion while benzene, chloroform fractions showed
el título de anticuerpos, la respuesta DTH, la insignificant changes. The increase in carbon
función fagocítica y la mielosupresión inducida clearance index reflects the enhancement of pha-
por ciclofosfamida en ratones. La administración gocytic function of mononuclear macrophage and
del extracto de metanol y sus fracciones mostró non- specific immunity. Phagocytosis by macro-
actividad inmunoestimuladora. Se obtuvo una phages is important against the smaller parasites
estimulación significativa con respecto a estos and its effectiveness is markedly enhanced by
parámetros con el extracto de metanol, la frac- opsonisation of parasite with antibodies and com-
ción de éter de petróleo y la fracción de metanol plement C3b leading to more rapid clearance of
11sobrante, mientras que las fracciones de cloro- parasite from blood . The antibody production
formo y benceno mostraron cambios poco signi- to T-dependent antigen SRBCs requires the co-
ficativos. El aumento en el índice de depuración operation of T and B-lymphocytes and macro-
12del carbón reflejó la mejora de la función fago- phages . Results obtained during present inves-
cítica de macrófagos mononucleares y de la in- tigation showed increased antibody production
munidad no específica. La fagocitosis de los in response to SRBCs.
macrófagos es importante frente a los parásitos DTH is antigen specific and causes erythema
de menor tamaño y su efectividad mejora nota- and induction at the site of antigen infection in
blemente gracias a la opsonización de los pará- immunized animals. The histology of DTH can
sitos mediante los anticuerpos y el complemento be different for different species, but the general
C3b que es el encargado de una depuración más characteristics are an influx of immune cells at
11rápida de los parásitos de la sangre . La produc- the site of injection, macrophages and Basophils
ción de anticuerpos frente a los eritrocitos de in mice and induction becomes apparent within
24-72 hours. T-cells are required to initiate thecordero (SRBC, antígeno T-dependiente) requie-
13, 14re la cooperación de los macrófagos y los linfo- reaction .
12citos B . Los resultados obtenidos durante la Increase in the DTH response indicates that
presente investigación mostraron un aumento en drug has a stimulatory effect on lymphocytes and
necessary cell types required for the expressionla producción de anticuerpos en respuesta a los
eritrocitos de cordero. reaction. DTH response, which is direct co-rela-
La respuesta DTH es específica del antígeno te of cell-mediated immunity, was significantly
15y causa eritema e inducción en el lugar de la increased as compared to untreated control .
inyección del antígeno en animales inmuniza- Statistically significant rise in HA titre, DTH
dos. La histología de la hipersensibilidad retar- response and phagocytic activity of petroleum
dada (DTH) puede variar según la especie, pero ether and remaining methanol fraction suggest
una característica general es la llegada de célu- that active principles of flower heads which are
las del sistema inmune al lugar donde se realiza responsible for stimulation of antibody respon-
la inyección, macrófagos y basófilos en el caso se, cell mediated response and phagocytic func-
de los ratones en los que la inducción resulta tion can be extracted with both polar and non
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evidente a las 24-72 horas. Las células T son polar solvents.
13, 14necesarias para iniciar la reacción . In the case of cyclophosphamide induced
myelosuppression, remaining methanol fractionEl aumento de la respuesta DTH indica que
of methanol extract was able to bring back theel fármaco produce un efecto estimulador sobre
los linfocitos y los tipos de células necesarias levels of WBC to the normal while other fractio-
para la expresión de la reacción. La respuesta ns were ineffective suggesting that polar compo-
DTH, que es el correlato directo de la inmunidad nents responsible for protection against cyclo-
celular, aumentó significativamente en compara- phosphamide myelosuppression. The protective
15. effect of remaining methanol fraction of metha-ción con el grupo de control no tratado
El aumento estadísticamente significativo del nol extract against myelosuppression induced by
título de anticuerpos humorales, la respuesta DTH cyclophosphamide is comparable with those ob-
16y la actividad fagocítica de la fracción de éter de tained for Asparagus racemosus and W. somni-
17.petróleo y la fracción de metanol sobrante sugi- fera
A few phytoconstituents from the plant haverió que los principios activos de las cabezas flo-
rales, responsables de la estimulación de la res- already been isolated; three new eudesmanolides
puesta de anticuerpos, la respuesta celular y la along with two sesquiterpenoids, cryptomeridiol
18función fagocítica, se pueden extraer con disol- and 4-epicryptomeridiol , three closely related
ventes polares y no polares. new hydroxy lactone have been isolated from
19.En el caso de la mielosupresión inducida por chloroform extract of flower heads S.indicus
20ciclofosfamida, la fracción de metanol sobrante Isolation of alkaloids from flowers and isola-
del extracto de metanol consiguió devolver el tion of 7-hydroxy-3’, 4’.5, 6-tetramethoxy-fla-
nivel de leucocitos a su nivel normal, mientras vone 7-O-β-D-(1→4)-diglucoside: a new flavo-
21 alsoque el resto de fracciones no dieron resultado, lo ne glycoside from the stem of S.indicus
reported. An antimicrobial principle isolated fromque sugirió que los componentes polares son los
responsables de la protección frente a la mielo- petrol ether extract was identified as bicyclic
22supresión por ciclofosfamida. El efecto protec- sesquiterpene lactone . One Sesquiterpene glyco-
tor de la fracción de metanol sobrante del ex- side isolated from methanol extract of S.indicus
tracto de metanol frente a la mielosupresión was responsible for increased antibody produc-
23tion .inducida por ciclofosfamida es comparable a los
16efectos obtenidos con Asparagus racemosus y Sesquiterpene lactones are proven as impor-
17W. somnifera . tant phytoconstituents with different pharmaco-
Ciertos fitoconstituyentes de la planta ya se logical activities such as antibacterial (especia-
han aislado; tres nuevos eudesmanólidos junto lly against gram positive bacteria), antifungal and
con dos sesquiterpeniodes, criptomeridiol y 4- anthelmentic activity. Some act as anti-parasitic
18epi-criptomeridiol , tres nuevas hidroxilactonas agent- artemisinin an antimalarial of proven effi-
24estrechamente relacionadas se han aislado del cacy in humans . Recently three new Sesquiter-
extracto de cloroformo de las cabezas florales de pene glycosides isolated from Dendrobium nobi-
19. Aislamiento de los alcaloides de lasS.indicus le were reported for their immunomodulatory
20 25flores y aislamiento de 7-hidroxi-3’, 4’.5, 6- potential . During the present study Sesquiter-
tetrametoxiflavona 7-O-β-D-(1→4)-diglucósido: pene lactones were found in non-polar fractions
También se identificó un nuevo glicósido de fla- while remaining methanol fraction was devoid
21vonol en el pecíolo de S.indicus . Un principio of these constituents. The activity of petroleum
antimicrobiano aislado del extracto de éter de ether, benzene and chloroform fractions may
petróleo se identificó como lactona sesquiterpé- therefore be attributed to the presence of such
22nica bicíclica . Un glicósido sesquiterpénico non-polar type of compounds. However, protec-
aislado del extracto de metanol de S.indicus fue tion against cyclophosphamide myelosuppression
el responsable del aumento de la producción de was observed by only remaining methanol frac-
23.anticuerpos tion, suggests the content of constituents other
Las lactonas sesquiterpénicas son importan- than sesquiterpenoids which were also responsi-
tes fitoconstituyentes de probada eficacia con ble for increased humoral and cellular response.
variadas actividades farmacológicas como, por The present investigation therefore reveals that
ejemplo, actividades antibacterianas (especialmente flower heads of S.indicus certainly possess im-
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frente a la bacteria Gram positiva), antifungales munomodulatory properties. The exact mecha-
y antihelmínticas. Algunas lactonas, como el nism of action, however, could only be unfolded
artesunato, actúan como agentes antiparasitarios, after detailed characterization of active moieties
con una probada eficacia antimalaria en huma- from different fractions. Studies on these lines
nos. Recientemente, se ha demostrado el poten- have already been taken up and shall follow in
cial inmunomodulador en tres nuevos glicósidos our future communications.
sesquiterpénicos aislados de Dendrobium nobile.
Durante el presente estudio las lactonas sesqui-
terpénicas se encontraron en las fracciones no ACKNOWLEDGEMENT
polares, mientras que la fracción de metanol
sobrante carecía de estos constituyentes. Por tanto, A.R.Bafna wishes to thank to The CSIR, New
es posible atribuir la actividad de las fracciones Delhi, India for providing financial assistance
de éter de petróleo, benceno y cloroformo a la (SRF) for carrying out this work.
presencia de este tipo de compuestos no polares.
Sin embargo, la protección frente a la mie-
losupresión por ciclofosfamida se observó sólo
en la fracción de metanol sobrante, lo que sugie-
re un contenido de constituyentes distintos de
los sesquiterpenoides, que son los responsables
del aumento de la respuesta celular y humoral.
Por tanto, la presente investigación revela que
las cabeza florales de S.indicus posee con certe-
za propiedades inmunomoduladoras. El mecanismo
exacto de actuación, sin embargo, sólo se pudo
desarrollar después de la caracterización detalla-
da de la parte activa de las distintas fracciones.
Se han tenido en cuenta los estudios en esta lí-
nea y se continuarán teniendo en cuenta en futu-
ras investigaciones.
AGRADECIMIENTOS
A.R.Bafna desea dar las gracias a CSIR, New
Delhi, India por su ayuda financiera (SRF) para
el desarrollo de este trabajo.
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