Corrigé Bac STL Biotechnologie 2014

De
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Épreuve : sciences physiques
Session 2014
Durée de l’épreuve : 3h
Coefficient : 4
PROPOSITION DE CORRIGÉ
2
Publié le : jeudi 19 novembre 2015
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BACCALAURÉAT
TECHNOLOGIQUE
Série: Sciences et Technologies de Laboratoire Spécialités :Biotechnologies
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SESSION 2014
Sousépreuve écrite de Biotechnologies
MARDI 17 JUIN 2014
Coefficient de la sousépreuve : 4
Ce sujet est prévu pour être traité en deux heures.
Les sujets de CBSV et de biotechnologies seront traités sur des copies séparées.
L’usage de la calculatrice est autorisé.
Ce sujet comporte9pages.
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OPTIMISATION D’UN PROCESSUS DE FERMENTATION D’UN RÉSIDU DE L’INDUSTRIE CÉRÉALIÈRE : LE SON DE BLÉ
Une entreprise souhaite valoriser le son de blé, un des produits obtenu lors de l’extraction de la farine du grain de blé. Le son de blé subit diverses transformations qui aboutissent à un extrait liquide : le sirop de son de blé. Ce sirop riche en glucides permet par fermentation d’obtenir de l’acide lactique capable de polymériser en acide polylactique (P.L.A.). Ce biopolymère permet de fabriquer des emballages biodégradables.
Le laboratoire de recherche et développement de l’entreprise souhaite optimiser la production d’acide lactique en fermenteur à partir des glucides du sirop de son de blé. Le laboratoire se donne trois objectifs : choisir une souche bactérienne capable d’utiliser les glucides présents dans le sirop de son de blé ; optimiser la production d’acide lactique par la souche sélectionnée ; construire une souche génétiquement modifiée productrice d’acide Dlactique.
1. CHOIX D’UNE SOUCHE PRODUCTRICE D’ACIDE LACTIQUE CAPABLE D’UTILISER LES GLUCIDES DU SIROP DE SON DE BLÉ 1.1. Identification des glucides présents dans le sirop de son de blé Afin d’identifier les glucides présents dans le sirop de son de blé, une chromatographie sur couche mince (CCM) est réalisée. Q1. Interpréter les résultats du chromatogramme fourni dans ledocument 1. Dépôt 1 Dépôt 2 Dépôt 3 Dépôt 4 Dépôt 5 d (cm)3,7 5,02,6 1,5 2,6 3,7 5,0 5,8 D (cm)6,6 Rf 0,39 0,23 0,39 0,56 0,76 0,88 0,56 0,76 (sans unité) Gris Gris Gris Gris Gris intensité intensité Gris foncé intensité intensité blanc Gris clair couleur clair moyenne moyenne moyenne moyenne d : distance de migration du soluté (en cm) D : distance de migration du front de solvant (en cm) Rf : rapport frontal d Rf = D Pour le dépôt 3, on observe 4 « spots », cela implique que l’échantillon contenait au moins 4 glucides différents. En tenant compte des Rf et couleur des solutions de référence, on peut supposer que le sirop de son contient (analyse des spots de bas en haut du chromatogramme): er 1 spot : Rf =0,39 = Rfglucoseet couleur identique donc il y a présence de glucose. ème 2 spot : Rf = 0,56 = Rfarabinoseet couleur identique donc il y a présence d’arabinose. ème 3 spot : Rf = 0,76 = Rfxyloseet couleur identique donc il y a présence de xylose. ème 4 spot : aucune solution de référence n’a de Rf et couleur correspondants. Le mélange contient du glucose, de l’arabinose, du xylose et un autre glucide. Q2. Tous les glucides présents dans le sirop de son de blé ne sont pas identifiables par cette CCM. Proposer une adaptation du protocole afin d’identifier tous les glucides présents. On peut ajouter d’autres solutions de référence correspondant à d’autres glucides probable comme le sorbitol, fructose …
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1.2. Identification de souches capables de fermenter les glucides présents dans le sirop de son de blé et de produire de l’acide lactique Le laboratoire dispose de plusieurs souches deLactobacillusproductrices d’acide lactique. La fermentation des glucides pour chaque souche est étudiée grâce à une microgalerie. Un extrait de la fiche technique de cette microgalerie ainsi que les résultats obtenus sont présentés dans ledocument 2. Q3. A partir de l’analyse du document, expliquer le principe de lecture d’une cupule positive et préciser sa couleur. Une cupule positive correspond à une cupule où le glucide, unique source carbonée, a été utilisé pour la croissance du microorganisme. Son utilisation entraîne la production de composés acides ce qui rend le pH < 5,2. L’indicateur coloré (BCP) passe alors du pourpre au jaune. La cupule apparait ainsi jaune à l’œil nu. Q4. A partir de la réponse à la questionQ1et des résultats fournis dans ledocument 2, argumenter le choix de la souche la plus adaptée à la production d’acide lactique à partir des glucides présents dans le sirop de son de blé. La souche à utiliser doit être capable de dégrader les glucides présents dans le son de blé c’està dire xylose, arabinose, glucose et un autre glucide inconnu. Les 2 souches capables de dégrader ces glucides sontLactobacillus bifermentans et pentosus. 1 On remarque aussi que la production d’acide lactique est la meilleure (5,6 g.L ) lorsqu’on utilise la souche deLactobacillus bifermentans.
2. OPTIMISATION DE LA PRODUCTION D’ACIDE LACTIQUE Afin de suivre la production d’acide lactique produit au cours de la fermentation, un dosage d’acide lactique est réalisé selon la fiche technique fournie dans ledocument 3. 2.1. Dosage de l’acide lactique La fermentation produit deux formes d’acide lactique : l’acide Llactique et l’acide Dlactique. Q5 Repérer dans ledocument 3ce qui permet d’affirmer que le coffret de dosage choisi est adapté au dosage de ces deux formes. Le coffret du dosage mentionne deux réactions principales : Celle catalysée par la DLDH (réactif R4, substrat = acide Dlactique) et celle catalysée par la LLDH (réactif R5, substrat = acide L lactique). Les deux formes d’acide lactique seront ainsi dosées par ce kit. Q6 Expliquer l’évolution de l’absorbance à 340 nm. Le coenzyme NAD a un spectre d’absorption qui diffère en fonction de son état oxydé ou réduit. A 340 nm, seule la forme réduite absorbe la lumière. Cette forme réduite n’existe pas en début de réaction mais est produite au fur et à mesure que l’acide lactique est oxydé en pyruvate. L’absorbance augmentera donc petit à petit. Q7 Expliquer ce qui est mesuré par chacune des absorbancesA1,A2etA3de l’essai. En A1, on mesure l’absorbance provenant de l’échantillon (absorbance intrinsèque qui peut être + associée à la présence de NADH, H dans l’échantillon au départ). En A2, on mesure l’absorbance associée à la présence d’acide Dlactique dans l’échantillon + l’absorbance provenant à l’origine de l’échantillon. En A3, on mesure l’absorbance associée à la présence d’acide Llactique dans l’échantillon + celle associée à la présence d’acide Dlactique + celle provenant à l’origine de l’échantillon. Q8 Calculer le volume de milieu réactionnelVMRlors de la lecture deA3. VMR= VR1+ VR2+ VR3+ Veau+ Véchantillon+ VR4+ VR5 Tous les volumes sont en mL. VMR= 1 + 0,2 + 0,02 + 0,9 + 0,1 + 0,02 + 0,02 = 2,26 mL Q9Etablir l’équation aux unités et aux valeurs numériques de ρ(ac. lactique ; échantillon). Vérifier, par 1 le calcul, que ρ(ac. lactique ; échantillon)= 5,6 g.L . Données :∆Aac. lactique total=∆ADac. lactique+∆ALac. lactique= 0,344 Facteur de dilution:Fd= 50 ∆A ac. lactique totalVMR0,344 2,26 ρ(ac. lactique ; échantillon)× M= × acide lactique× Fd = 90,1 × 50× × ε0,1× l V 6300 × 1 NADH échantillon 1 1 ρ(ac. lactique ; échantillon)= 5,56 g.L soit environ 5,6 g.L
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2.2. Choix du milieu de culture adapté à la production d’acide lactique Afin d’optimiser la production d’acide lactique à moindre coût, la souche deLactobacilluschoisie est cultivée dans deux milieux A et B dérivés du milieu MRS additionné des glucides du sirop de son de blé (présentés dans ledocument 4) Les sources d’azote présentes dans les milieux de culture comme les peptones, les extraits de levure et les extraits de viande, sont des ingrédients coûteux pour les industriels. Les éléments minéraux le sont beaucoup moins. L’entreprise choisit le milieu B pour la production d’acide lactique. Q10 Argumenter ce choix à l’aide dudocument 4. Constituants Milieu AcomparaisonMilieu B Nature coût Extrait de levure 8,75 > 5 PepSource d’N 10 > 2,5 tone de caséine cher Extrait de viande 10 > 2,5 NH4cherPO4 2 minéraux Peu > 0,5 Tween 80 1 = 1 détergent  Phosphate 2 = 2 dipotassique Citrate de sodium 5 < 7,5 minéraux Peu cher Phosphate 0,2 < 3 d’ammonium Sulfate de manganèse 0,05 < 0,05 Le document 4 montre que la souche croît de façon équivalente dans les deux milieux (le milieu B montre une phase de latence de 2H, la phase de croissance exponentielle dure quasiment aussi longtemps pour les deux milieux et présente une pente (donc un taux de croissance) identique, la phase stationnaire est atteinte après 12 H de forte croissance. La production d’acide lactique est la même quel que soit le milieu. Le milieu B contient moins de constituants coûteux que le milieu A tout en permettant d’obtenir une culture équivalente et une production d’acide lactique identique.
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3.
CONSTRUCTION D’UNLACTOBACILLUSGÉNÉTIQUEMENT MODIFIÉ PRODUCTEUR D’ACIDE DLACTIQUE Afin de produire des biopolymères de P.L.A. plus résistants, il est préférable d’utiliser la forme D de l’acide lactique. Pour cela, la souche deLactobacilluschoisie a été modifiée génétiquement : le gène codant la L LDH a été inactivé puis un plasmide noté pDLDH contenant le gène DLDH a été introduit dans cette souche. Q11.Schématiser et annoter les deux étapes décrites cidessus permettant d’obtenir la souche génétiquement modifiée à partir de la souche sauvage deLactobacillus. Gène LLDH
Lactobacillus Chromosome bactérien
Elément inactivant le gène ; Méthylation de l’ADN au niveau de la région promotrice par exemple
Gène inactivé
Transfert du plasmide au sein de la souche bactérienne
Plasmide pDLDH
Sélection de la souche ayant intégré le plasmide par culture sur milieu avec ampicilline et tétracycline
Le technicien veut vérifier l’identité du plasmide introduit dans la souche deLactobacillus. Pour cela, il extrait le plasmide et réalise une digestion enzymatique suivie d’une électrophorèse en gel d’agarose. Ledocument 5présente la carte de restriction du plasmide pDLDH ainsi que les résultats de la migration électrophorétique après coupure du plasmide extrait par les enzymes de restriction BamH1 etPst1. Q12 Déterminer la taille approximative des fragments d’ADN obtenus après coupure par les enzymes de restriction. A l’aide de la carte de restriction duplasmide, on en déduit : Plasmide Plasmide non Plasmide Plasmide + BamH1 digéré + BamH1 + Pst1 + Pst1 Nombre de 1 circulaire 1 linéaire 1 linéaire 2 linéaires fragments Environ 750 pb Taille duet 3174 pb 3174 pb 3174 pb fragment(3174 – 752 =) Environ 2420pb
Q13 Démontrer que le plasmide extrait correspond au plasmide pDLDH. L’électrophorégramme montre la présence de : 1 fragment d’environ 3000 pb après action de BamH1 1 fragment d’environ 3000 pb après action de Pst1 1 fragment d’environ 750 pb et un second fragment d’environ 2500 pb après action de BamH1 et Pst1. 14BIOME1 Page5sur11
Ces résultats coïncident avec ce qui est attendu après action de ces enzymes de restriction sur le plasmide pDLDH (cf. tableau précédent). Si le plasmide présent avait été le vecteur sans le gène, on aurait obtenu un fragment unique et plus court après action de BamH1 ou de Pst1 : environ 2500 pb au lieu de 3000 pb.
SYNTHESE
Q14 Rédiger une synthèse regroupant l’ensemble des éléments permettant une production optimale, à moindre coût d’acide Dlactique à partir du sirop de son de blé. Pour produire de façon optimale de l’acide lactique, l’industriel va transformer la souche Lactobacillus bifermentansen inactivant le gène LLDH car cette souche utilise tous les glucides présents dans le sirop de son de blé et a la meilleure production en acide lactique. On obtient une souche modifiée par ajout d’un plasmide pDLDH. La souche génétiquement modifiée est ensuite mise en culture en fermenteur avec le milieu B qui est moins coûteux.
Q15 Proposer un avantage de fabriquer des emballages à partir d’un biopolymère de l’acide lactique. En utilisant le déchet « son de blé » l’entreprise diminue la quantité de déchets issue de la production de farine de blé (valorisation des déchets). Cet emballage est biodégradable alors que la plupart des déchets issus de polymérisation par voie chimique se dégradent peu ou pas.
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DOCUMENT 1 : Chromatographie sur couche mince du sirop de son de blé
Principe La chromatographie sur couche mince (CCM) est une méthode de séparation qui permet l'identification des différents constituants d'un mélange. Cette technique repose sur la différence de solubilité d'une substance dans deux phases non miscibles: la phase stationnaire, liée au support adsorbant ; c'est une couche de silice hydratée déposée sur une feuille d'aluminium ; la phase mobile constituée par le solvant ; le solvant est choisi pour son aptitude à solubiliser sélectivement les constituants du mélange sans réagir avec eux.
Résultats obtenus pour le sirop de son de blé
1
Nature des dépôts :
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1. 2. 3. 4. 5.
2
3
Glucose Maltose Echantillon de sirop de son de blé Arabinose Xylose
4
5
Ligne de front de migration du solvant
Ligne de dépôt des échantillons
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DOCUMENT 2 : Identification de la souche capable d’utiliser les glucides du son de blé Extrait de la fiche technique de la microgalerie « API 50 CHL Medium »
Principe :Le microorganisme à tester est mis en suspension dans le milieu « API 50 CHL Medium » puis inoculé dans chaque tube de la galerie. Chaque tube contient un glucide différent sous forme déshydratée (seule source de carbone). Pendant l’incubation, le catabolisme des glucides conduit à la production d’acides organiques qui provoquent le virage de l’indicateur de pH. Les résultats obtenus constituent le profil biochimique permettant l’identification du microorganisme à l’aide du logiciel d’identification.
Le milieu « API 50 CHL Medium » destiné à l’identification du genreLactobacilluset germes apparentés est prêt à l’emploi. Il permet l’étude de la fermentation des 49 glucides de la galerie « API 50 CHL Medium ».
Composition du milieu 50 CHL Medium Polypeptone Extrait de levure Tween 80 Phosphate dipotassique Acétate de sodium Citrate d’ammonium Sulfate de magnésium Sulfate de manganèse Bromocrésol pourpre Eau déminéralisée
10 g 5 g 1 mL 2 g 5 g 2 g 0,20 g 0,05 g 0,17 g qsp* 1000 mL *qsp : quantité suffisante pour
Zone de virage du bromocrésol pourpre (BCP) : pH < 5,2 : jaune ; pH > 6,8 : pourpre
Profils de fermentation obtenus après 48 h d’incubation à 35°C
Souches Lactobacillus curvatus Lactobacillus bifermentans Lactobacillus pentosus Lactobacillus cellobiosus
Arabinose + + +
Glucose + + + +
Maltose + + + +
Fructose + + + +
Sorbitol +
Xylose + +
Production d’acide lactique obtenue en 24 h à 35°C, pH 5,6 La culture des différentes souches est effectuée en bouillon MRS additionné de sirop de son de blé.
Souches Lactobacillus curvatus Lactobacillus bifermentans Lactobacillus pentosus Lactobacillus cellobiosus
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1 Production d’acide lactique(en g.L ) 1,9 5,6 4,8 3,2
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DOCUMENT 3 : Extrait de la fiche technique du coffret de dosage de l’acide lactique
Principe Le dosage de l’acide lactique dans l’échantillon nécessite que cette molécule soit consommée grâce aux réactions mises en jeu, cellesci doivent donc être totalement déplacées vers la production de pyruvate (rôle de la réaction 3). Il est nécessaire d’attendre la fin de la réaction pour effectuer le mesurage.
Réactions mises en jeu : (1) Dlactate + NAD (2) Llactate + NAD (3) pyruvate + Lglutamate
DLDH
LLDH
GPT
DLDH : Dlactate deshydrogénase LLDH : Llactate deshydrogénase GPT : glutamate pyruvate transaminase
pyruvate + NADH pyruvate + NADH Lalanine + 2oxoglutarate
L’augmentation de l’absorbance du mélange réactionnel est mesurée à 340 nm. Le NADH absorbe à 340 nm. Mode opératoire Réactifs en quantité suffisante Procédure d’essai : longueur d’onde 340 nm
Ajuster le spectrophotomètre au zéro d’absorbance contre de l’eau
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DOCUMENT 4 : Productions d’acide lactique dans deux milieux A et B
Influence du milieu de culture sur la croissance bactérienne
Influence du milieu de culture sur la production d’acide lactique
1 Composition des milieux A et B en g.L
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DOCUMENT 5 : Contrôle du plasmide recombinant pDLDH Cartographie du plasmide pDLDH
Electrophorégramme des fragments d’ADN obtenus après coupure du plasmide extrait L’électrophorèse sur gel d’agarose permet de séparer les fragments d’ADN chargés négativement en fonction de leur masse moléculaire.
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julie.t

jbjjio

jeudi 7 avril 2016 - 11:19

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