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Description

Caractérisation de la diversité microbienne aeroportée des biogazAuteur : Marina MOLETTADirecteur de thèse : Jean-Jacques GODONLaboratoire de biotechnologie de l’environnement, INRA, Narbonne« Fil d’Ariane » entre tous les écosystèmes, l’air est certainement Dans cette étude, la microflore aéroportée des biogaz a étéle meilleur vecteur de dissémination pour les micro-organismes caractérisée de manière quantitative (comptage en microscopie,3et, avec 14 m d’air inspiré par jour pour l’homme, une source PCR quantitative en temps réel) et qualitative (empreintesde contact microbien non négligeable. Un certain nombre de moléculaires et inventaires).sources naturelles ou anthropiques ont été identifiées, dispersantdes aérosols microbiens par l’air et plus largement les gaz. I MéthodologieDans le contexte actuel de l’augmentation de la production dedéchets, la digestion anaérobie et la valorisation du biogaz ainsi Les sites de prélèvements de cette étude ont été choisis enproduit apparaissent comme des solutions d’avenir pour leur fonction de 3 critères : le type de déchets traités, le type detraitement. La valorisation du biogaz est au centre d’un double procédé réalisant la digestion anaérobie et la température deenjeu : augmenter la part des énergies « vertes » dans la fonctionnement. 5 sites de différentes localisations ont étéconsommation énergétique et limiter l’impact du biogaz sur choisis selon ces critères. La flore totale du biogaz a été ...

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Extrait

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DÉCHETS - REVUE FRANCOPHONE D’ÉCOLOGIE INDUSTRIELLE - CAHIER SPÉCIAL DU NUMÉRO 44 - DÉCEMBRE 2006 - REPRODUCTION

INTERDITE

« Fil d’Ariane » entre tous les écosystèmes,l’air est certainement

le meilleur vecteur de dissémination pour les micro-organismes

et, avec 14 m

3

d’air inspiré par jour pour l’homme, une source

de contact microbien non négligeable. Un certain nombre de

sources naturelles ou anthropiques ont été identifiées,dispersant

des aérosols microbiens par l’air et plus largement les gaz.

Dans le contexte actuel de l’augmentation de la production de

déchets, la digestion anaérobie et la valorisation du biogaz ainsi

produit apparaissent comme des solutions d’avenir pour leur

traitement. La valorisation du biogaz est au centre d’un double

enjeu : augmenter la part des énergies « vertes » dans la

consommation énergétique et limiter l’impact du biogaz sur

l’effet de serre. Son mode de production biologique et son

éventuelle injection dans le réseau de gaz narurel pose la

question de sa composition microbiologique. Plusieurs risques

peuvent être évoqués tels que l’altération du réseau par des

phénomènes de biocorrosion, des fuites dans le réseau sur les

lieux de production ou d’utilisation pouvant conduire à une

exposition des personnes à ces aérosols microbiens. Dans le

but de connaître la composition microbiologique du biogaz,

l’ADEME et Gaz de France se sont associés dans un programme

de recherche dans lequel s’inscrit ce travail.Cette étude est une

approche préliminaire et n’a pas pour objectifs d’évaluer le

risque microbiologique sanitaire et corrosif lié au biogaz. Le but

est de faire un état des lieux qualitatifs et quantitatifs de la

microflore transportée par les biogaz ;ceci permettant d’orienter

de futures recherches.

Cette question a été étudiée dans ce travail à partir de

6 biogaz issus de 5 sites de productions différents à l’aide des

outils moléculaires permettant de s’affranchir des biais liés à la

cultivabilité des micro-organismes.

Dans cette étude, la microflore aéroportée des biogaz a été

caractérisée de manière quantitative (comptage en microscopie,

PCR quantitative en temps réel) et qualitative (empreintes

moléculaires et inventaires).

I Méthodologie

Les sites de prélèvements de cette étude ont été choisis en

fonction de 3 critères : le type de déchets traités, le type de

procédé réalisant la digestion anaérobie et la température de

fonctionnement. 5 sites de différentes localisations ont été

choisis selon ces critères.La flore totale du biogaz a été observée

et comptée par microscopie à épifluorescence (DAPI). Le

protocole d’extraction des acides nucléiques des aérosols

microbiens est donné par Moletta et al. (2005). La totalité de

l'ADNr 16S et 18S est amplifiée à l'aide des amorces universelles

Bactérie,Archées et Eucaryotes sont amplifiées. L’utilisation de

la PCR nichée a permis de réaliser les analyses SSCP (

Single Stand

Conformation Polymorphism

) et

les inventaires moléculaires.

Ces résultats de description de la diversité microbienne

aéroportée des biogaz ont permis de définir 5

groupes

microbiens, choisis comme témoins de l’aérosolisation

différentielle. Ces groupes sont Bactéries,Archées, Synergistes,

Staphylococcus spp

. et

Propionibacterium acnes

. Ils ont été

quantifiés par PCRq dans le biogaz et dans sa source,le digesteur

anaérobie pour les 6 matrices issue des biogaz et les 4 matrices

issues du contenu du digesteur anaérobie.

II Les Résultats

II.1) La description diversité microbienne aéroportée des

biogaz

La diversité microbienne transportée par les biogaz a été

décrite quantitativement et qualitativement.

Caractérisation de la diversité microbienne

aeroportée des biogaz

Auteur : Marina MOLETTA

Directeur de thèse : Jean-Jacques GODON

Laboratoire de biotechnologie de l’environnement, INRA, Narbonne

Les résultats des comptages en microscopie à épifluorescence

montrent qu’elle est caractérisée par une quantité de cellules

relativement constante autour 106 cellules procaryotes/m

3

et

104 cellules eucaryotes/m

3

. L’analyse globale de la diversité par

SSCP montre que les diversités microbiennes des biogaz sont

qualitativement différentes et différent également du contenu

du digesteur.La microflore Bactérie en aérosol est plus complexe

que celles des Eucaryotes. L’identification des espèces Bactérie

et Eucaryote présentes dans le biogaz confirme les différences

observées par empreintes moléculaires au sein des diversités

des biogaz et montre qu’il n’y a pas, en terme de diversité

microbienne, « un biogaz » mais « des biogaz ». Cependant,

cette diversité présente des points communs à la fois au niveau

des phyla, des sous-groupes et des espèces retrouvés dans les

différents biogaz. Les résultats des inventaires moléculaires

montrent une grande diversité des espèces présentes dans

les biogaz (Figure 1). Pour le domaine Bactérie, 499 séquences

d’ARNr 16S ont été réalisées se regroupant en 183 espèces.

Parmi les espèces en aérosols dans le biogaz, une proportion

de 44 % de l’abondance représente une diversité bactérienne

inconnue.Les diversités bactériennes des biogaz sont différentes

en termes d’espèces présentes. Cependant, elles présentent

certaines concordances aux niveaux des phyla. De manière

générale, la diversité totale des biogaz décrite à partir des

6 échantillons de biogaz analysés est dominée par le

phylum

Firmicutes

avec

Clostridium spp

. et

Bacillus spp

. comme sous-

groupes dominants. Les 5 classes de Protéobactéries sont

retrouvées avec une dominance des

Alphaproteobacteria

et

des

Gammaproteobacteria

, représentant 14 % et 12 % de

l’abondance. Elles sont dominées par

Acetobacter spp.

,

Sphingomonas spp.

, et

Psychrobacter spp.

. Les Bactéroidetes

représentent 13 % de l’abondance totale et sont dominés par

les sous-groupes

Prevotella spp

. et

Rickenella spp

.

Dans le cas de la diversité des Eucaryotes, 177 séquences

d’ADNr 18S ont été réalisées dont 87 appartiennent au règne

des champignons et des levures. Certains groupes ont été

retrouvés dans plusieurs biogaz :

Cladosporium sp., Hortea

werneckii,Trichosporon sp.,

et

Aspergillus terreu

s, qui est l’espèce

la plus abondante (15 % de l’abondance).

Figure 1 : Groupes bactériens retrouvés dans la diversité bactérienne des biogaz.

Seuls les groupes supérieurs à 3 % d’abondance sont représentés. Les groupes

Deltaproteobacteria et Epsilonproteobacteria, Chlamydia/Planctomyces,

Synergistes,

Cyanobacteria,

Deinococcus/Thermus,

Acidobacteria,

Gemmatimonadetes et Fusobacteria

ainsi que les groupes n’ayant pas de

représentant cultivé OP05,WS06 et WS01 ne sont pas représentés.

II.3. L’aérosolisation différentielle : son observation dans

le biogaz

La comparaison des empreintes moléculaires Bactérie et

Eucaryote des biogaz et de leur source montre que la diversité

microbienne transportée par le biogaz n’est pas une copie de

la communauté microbienne de sa source. Cette observation

est confirmée par les données des inventaires moléculaires.

En effet, des disparités importantes sont observées entre les

proportions des différents groupes microbiens au niveau du

phylum et du phylotype entre le biogaz et son digesteur

anaérobie source.

Des comportements d’aérosolisation différents semblent être

la cause principale de ces disparités entre les deux diversités

microbiennes.

Ainsi, trois comportements ont été mis en évidence dans le

biogaz (Figure 2) :

• L’aérosolisation active : elle caractérise les micro-organismes

préférentiellement aérosolisés. L’aérosolisation active a été

montrée quantitativement pour

Staphylococcus spp.

et

Propionibacterium acnes

.

• La non-aérosolisation active : elle caractérise les micro-

organismes non-préférentiellement aérosolisés. La non-

aérosolisation active a été montrée quantitativement pour les

Archées et les Synergistes.

• L’aérosolisation passive : elle est mise en évidence par la

détection dans le biogaz de micro-organismes non-

préférentiellement aérosolisés. La présence dans le biogaz de

ces micro-organismes montre qu’en supplément des deux

comportements « actifs », il existe une aérosolisation passive,

probablement essentiellement tributaire de phénomènes

physiques conduisant n’importe lequel des groupes microbiens

du milieu source à se retrouver en aérosol.

Figure 2 : Comparaison des taux d’aérosolisation de chaque groupe. Les “boîtes à

moustaches” représentent la distribution schématique des valeurs du rapport

(Proportion du groupe dans le biogaz/proportion du groupe dans le digesteur) des

différents groupes choisis comme témoins d’aérosolisation différentielle. La validité

de la distribution a été évaluée par le calcul du coefficient de Spearman (0,88).

III Conclusions

Ce travail a permis de caractériser une diversité microbienne

jusqu’alors inconnue.Le biogaz apparaît être un vecteur pouvant

transporter n’importe laquelle des espèces composant l’énorme

diversité de sa source, provenant soit des déchets soit de la

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DÉCHETS - REVUE FRANCOPHONE D’ÉCOLOGIE INDUSTRIELLE - CAHIER SPÉCIAL DU NUMÉRO 44 - DÉCEMBRE 2006 - REPRODUCTION INTERDITE

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communauté microbienne de la digestion anaérobie.Cependant,

la diversité microbienne de l’air que nous respirons ainsi que

celle du gaz naturel ne sont pas à ce jour que très peu

documentées.Il est donc impossible d’évaluer les conséquences

sanitaires et corrosives de l’addition de cette microflore du

biogaz à la diversité microbienne déjà présente dans l’un ou

l’autre de ces deux environnements.

Cette étude est un point de départ pour de futures recherches

qui permettront de donner de plus amples informations sur

cette diversité microbienne en termes de dynamique spatiale

(de la production à l’injection) et temporelle.

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