Thèse présentée pour obtenir le grade de

Barbara Winsor

Description

Niveau: Supérieur
Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Louis Pasteur - Strasbourg I Discipline : Sciences de la Vie et de la Santé Spécialité : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie par Clélia Orange « Un fluorophore photoactivable pour des études spatio-temporelles de la dynamique du cytosquelette d'actine ; les interactions des protéines à domaine SH3, le cas de Bzz1p. » Soutenue publiquement le vendredi 6 juillet 2007 Devant les membres du jury : Directrice de Thèse : Mme Barbara Winsor, Directeur de Recherche, Strasbourg Directeur de Thèse : M. Maurice Goeldner, Professeur, Strasbourg Rapporteur Interne : M. Serge Potier, Professeur, Strasbourg Rapporteur Externe : M. Peter Philippsen, Professeur, Bâle, Suisse Rapporteur Externe : M. Carsten Schultz, Directeur de Recherche, Heidelberg, Allemagne

• christelle pour les analyses de spectrométrie de masse des protéines


• réactivité des assemblages biologiques du ministère de la recherche


• protéine


• moment difficile


• directeur de la recherche

Sujets

• Karsten
• Winsor
• Louis Pasteur University
• Potier
• Orange

Informations

• Publié par: profil-nechor-2012
• Publié le: 01 juillet 2007
• Nombre de lectures: 33
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 18 Mo

Extrait

Thèse présentée pour obtenir le grade de
Docteur de l’Université Louis Pasteur - Strasbourg I


Discipline : Sciences de la Vie et de la Santé
Spécialité : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie



par

Clélia Orange



« Un fluorophore photoactivable pour des études
spatio-temporelles de la dynamique du
cytosquelette d’actine ; les interactions des
protéines à domaine SH3, le cas de Bzz1p. »



Soutenue publiquement le vendredi 6 juillet 2007



Devant les membres du jury :

Directrice de Thèse : Mme Barbara Winsor, Directeur de Recherche, Strasbourg
Directeur de Thèse : M. Maurice Goeldner, Professeur, Strasbourg
Rapporteur Interne : M. Serge Potier, Professeur, Strasbourg Externe : M. Peter Philippsen, Professeur, Bâle, Suisse
Rapporteur Externe : M. Carsten Schultz, Directeur de Recherche, Heidelberg, Allemagne Remerciements
Le travail présenté dans cette thèse a été réalisé au laboratoire de Chimie Bioorganique
dirigé par le Professeur Maurice Goeldner et au laboratoire de Cytosquelette d’Actine et Trafic
Intracellulaire dirigé par le Docteur Barbara Winsor. Je tiens à les remercier pour m’avoir accueilli
dans leurs groupes et confié ce projet de thèse innovant à l’interface de la chimie et de la biologie,
de m’avoir soutenu tout au long de ce travail passionnant mais empli d’embûches.
Je tiens à remercier Messieurs Peter Philippsen, Serge Potier et Carsten Schultz pour
m’avoir fait l’honneur d’accepter de juger ce travail de thèse.
Je désire également remercier les différentes personnes qui ont participé à ce travail :
Alexandre et Chantal qui m’ont fait découvrir l’univers des levures et du cytosquelette
d’actine au tout début de ma thèse.
Karine qui m’a initié aux joies de la synthèse organique.
Alex qui grâce à ses judicieux conseils m’a permis d’obtenir ma molécule tant désirée et
aussi un grand merci pour les corrections de ce manuscrit.
Jean-Luc Vonesch, Didier Hentsch et en particulier Pascal pour l’initiation au monde de la
microscopie confocale.
Pascale pour la spectrométrie de masse des molécules chimiques et pour son aide pour la
purification et aussi pour les moments de détente, les grandes discussions et la piscine.
Christelle pour les analyses de spectrométrie de masse des protéines.
Je remercie et je souhaite aussi bon courage à David et à Adeline qui m’ont aidé pour les
expériences au cours de ma thèse et continuent mon projet.
Je n’oublie pas non plus les stagiaires que j’ai encadrés et qui m’ont permis d’avancer plus
sereinement dans ce projet : Catherine, Cédric et Laurence.
Je voudrais bien sur remercier tous les nombreux membres de la Faculté de Pharmacie et de
l’UMR7156 avec lesquels j’ai eu des relations et des échanges très enrichissants.
Je garderai toujours un excellent souvenir de ces moments passés, en particulier les
discussions quotidiennes autour d’une tasse de thé, avec les personnes du laboratoire de Chimie
Bioorganique : Bernard, Flo, Elias, Jean-Seb, Tic, Portia, Alexandre et Anne. Merci à Elias pour
ces merveilleux repas libanais.
èmeJe tiens aussi à remercier les membres du 4 étage de l’IPCB, en particulier : Gladys et
Johan pour leurs conseils et pour les corrections du manuscrit, Sylvie pour son enthousiasme et
Vincent, Albert, Lydia pour les discussions scientifiques ou non autour de la table du midi.
Un grand merci à Cathy pour son aide dans tous les petits tracas de la vie administrative
et l’organisation des pots. Toutes les sorties culturelles, les randonnées dans les Vosges et les
piques-niques gargantuesques m’ont permis de souffler et me laissent des soucvenirs impérissables.
Sans ma famille et mes amis, ce travail n’aurait pas pu aboutir. Merci à mes parents et mes
deux sœurs Elodie et Marjorie d’avoir été là et de m’avoir soutenu dans les moments de doute et
qui m’ont permis de revoir régulièrement « mes » montagnes. Merci aussi à mes amis du
Magistère : Christelle, Jérémy, Christophe et Julien et tous les amis de Strasbourg pour avoir été à
mes côtés et avoir partagé ses années de thèse. Et bien sur, je n’oublie pas non plus mes amis de
Grenoble et d’ailleurs : Samantha, tu m’as fait rêver avec tes photos de plongée, Nadège, Olivier.
Guillaume, ton soutien et ta patience tout au long de cette thèse qui fut un moment
difficile de ma vie m’ont permis de rester optimiste. Merci pour tout.
Je remercie finalement le programme ACI – Dynamique et Réactivité des assemblages
biologiques du Ministère de la Recherche, la Ligue contre le Cancer, l’Université Louis Pasteur et
le CNRS qui ont financé ces travaux. Table des matières
LISTE DES ILLUSTRATIONS 7
ABREVIATIONS 10
LISTE DES PROTEINES DE LEVURE ET DE LEURS FONCTIONS MENTIONNEES AU COURS
DE CE TRAVAIL 12
AVANT PROPOS 14
PARTIE 1. DEVELOPPEMENT D’UN FLUOROPHORE PHOTOACTIVABLE 16
CHAPITRE 1. FLUOROPHORES PHOTOACTIVABLES ET ETIQUETTES CHIMIQUES DE PROTEINES 17
I. PRINCIPE DE LA FLUORESCENCE 17
II. EXCITATION A DEUX PHOTONS 19
III. FLUOROPHORES PHOTOACTIVABLES 21
A. Critères d’un fluorophore photoactivable efficace 22
B. Stratégie générale 24
IV. GROUPEMENTS PHOTOLABILES 26
A. Groupements o-nitrobenzyles 26
B. s o-nitrophénéthyles 27
V. MARQUAGE SPECIFIQUE DE PROTEINES 29
A. Marqueurs protéiques 29
1) Protéines fluorescentes 29
2) uorescentes photoactivables 31
B. Marqueurs chimiques 33
1) Petites sondes utilisant le ciblage d’une séquence protéique 33
2) ee peptidique 37
3) Incorporation d’acides aminés non naturels 39
VI. OBJECTIFS 42
CHAPITRE 2. RESULTATS ET DISCUSSION 43
I. STRATEGIE REASH-EDT CAGE 2
A. Principe 43
B. Synthèses 44
II. STRATEGIE COUMARINE-NTA CAGEE 46
A. Principe 46
B. Synthèses 47
1) Le fluorophore 47
2) Le motif NTA 49 a) Cbz/SEM 49
b) Alloc/PMB 51
c) Cbz/tBu 53
3) Les cages 53
C. Propriétés photochimiques 54
1) Propriétés photophysiques 54
2) Réaction de photofragmentation 54
D. Tests cellulaires 58
1) Entrée cellulaire 58
2) Toxicité cellulaire 62
CHAPITRE 3. PERSPECTIVES 63
CHAPITRE 4. PARTIE EXPERIMENTALE 67
I. SYNTHESES 67
A. 1-(3,4-diméthoxyphényl)-2,2,2-trifluoro-éthanone (1) 67
B. 1-(2-nitro-4,5-diméthoxy-phényl)-2,2,2-trifluoro-éthanone (2) 68
C. 1-(2-nitro-4,y-phényl)-2,ro-éthanol (3) 68
D. 1-(2-nitro-4,5-diméthoxy-phényl)-2,2,2-trifluoro-chloroéthane (4) 69
E. Résorufine-4,5-bis(mercurique trifluoroacétate) (5) 69
F. 2,4-Dihydroxy-5-chloro-benzaldéhyde (6) 70
G. Acide 6-chloro-7-hydroxy-coumarine-3-carboxylique ou « coumarine » (7) 70
H. N,N-Bis(carboxyméthyl)-N-(carboxybenzyl)-L-lysine (8) 71
I. [Triméthylsilyl(éthoxy)]méthyl-N,N-bis{[2-triméthyl silyl(éthoxy)méthoxy]
carbonyl}-(carboxybenzyl)-L-lysine (9) 71
J. [Triméthylsilyl(éthoxy)]méthyl-N,N-bis{[2-triméthylsilyl(éthoxy)méthoxy]
carbonyl}-L-lysine ou « Lysine- NTA-SEM » (10) 72 3
K. « Coumarine-Lysine-NTA-SEM » (11) 73 3
L. « Ac-Coumarine-Lysine-NTA-SEM » (12) 73 3
M. « Cage-coumarine-Lysine-NTA-SEM » (13) 74 3
N. (tert-Butoxy)-N,N-bis(2-tert-butoxycarbonylméthy)l-Nε-carboxybenzyl-L-lysine
(14) 75
O. (tert-Butoxy)-N,N-bis(2-tert-butoxycarbonylméthyl)-L-lysine (15) 76
P. « Coumarine-Lysine-NTA-tBu » (16) 76 3
Q. « Cage-Coumarine-Lysine-NTA-tBu » (17) 77 3
R. « Cage-Couysine-NTA » (18) 78
S. « Ac-Coumarine-Lysine-NTA-tBu » (19) 78 3
T. ine-NTA » (20) 79 II. CULTURE DES CELLULES HELA 79
III. INCUBATION AVEC LES DIFFERENTS DERIVES DE LA COUMARINE 80
PARTIE 2. DYNAMIQUE ET RECHERCHE DE NOUVEAUX PARTENAIRES DE BZZ1P,
MEMBRE DE LA FAMILLE PCH 81
CHAPITRE 1. INTRODUCTION 82
I. LE CYTOSQUELETTE D’ACTINE
A. Fonctions du cytosquelette d’actine 82
B. Dynamique de la polymérisation 83
C. Nucléation érisation de l’actine 86
1) Le complexe Arp2/3 86
2) Les protéines de la famille WASP/Scar 90
a) Structure 90
b) Régulation 92
D. de la polymérisation de l’actine chez les mammifères 95
II. LE CYTOSQUELETTE D’ACTINE CHEZ SACCHAROMYCES CEREVISIAE 97
A. Le cycle de vie de la levure 97
B. Organisation et fonctions du cytosquelette d’actine chez la levure 99
1) Organisation du cytosquelette d’actine au cours du cycle cellulaire 99
2) Fonctions de l’actine chez la levure 100
3) Assemblage de l’actine dans les différentes structures 102
a) Les taches corticales d’actine : le complexe