Isolement et caractérisation des cellules souches leucémiques dans la Leucémie Aigüe Myéloïde

Xavier Ronot

Description

Niveau: Supérieur, Master, Bac+5
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences et Vie de la Terre MEMOIRE Présenté par Stéphane JOLY Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique Des Hautes Etudes Isolement et caractérisation des cellules souches leucémiques dans la Leucémie Aigüe Myéloïde Soutenu le : 2 février 2010 Devant le jury : Xavier RONOT Président Claire RACAUD-SULTAN Rapporteur Jean Marie EXBRAYAT Examinateur Xavier THOMAS Examinateur Véronique MAGUER-SATTA Examinateur Laboratoire EPHE : Reproduction et Développement des Vertébrés Directeur : Jean-Marie EXBRAYAT () 15 rue du Plat – 69 288 Lyon Cedex 02 Laboratoire d'accueil : INSERM U590 Oncogenèse et Progression Tumorale Directeur : Alain PUISIEUX Responsable scientifique : Véronique MAGUER-SATTA () Centre Léon Bérard – 28 rue Laënnec – 69 373 Lyon Cedex 08

• modification de l'expression des isoformes du gène tp73 en réponse aux traitements


• cellule souche leucémique


• réponse aux drogues de chimiothérapie


• cellule souche


• tp73


• lam


• mécanismes d'action de la niche hématopoïétique……………………………

Sujets

• Berard
• Puisieux
• Exbrayat
• Institut national de la santé et de la recherche médicale
• Thomas

Informations

• Publié par: profil-afte-2012
• Publié le: 01 février 2010
• Nombre de lectures: 69
• Langue: Français

Extrait

MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE
ET DE LA RECHERCHE



ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES

Sciences et Vie de la Terre

MEMOIRE

Présenté par

Stéphane JOLY


Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique Des Hautes Etudes


Isolement et caractérisation des cellules souches leucémiques
dans la Leucémie Aigüe Myéloïde



Soutenu le : 2 février 2010

Devant le jury :

Xavier RONOT Président
Claire RACAUD-SULTAN Rapporteur
Jean Marie EXBRAYAT Examinateur
Xavier THOMAS
Véronique MAGUER-SATTA Examinateur



Laboratoire EPHE : Reproduction et Développement des Vertébrés
Directeur : Jean-Marie EXBRAYAT ([e-mail])
15 rue du Plat – 69 288 Lyon Cedex 02

Laboratoire d’accueil : INSERM U590 Oncogenèse et Progression Tumorale
Directeur : Alain PUISIEUX
Responsable scientifique : Véronique MAGUER-SATTA ([e-mail])
Centre Léon Bérard – 28 rue Laënnec – 69 373 Lyon Cedex 08 RESUME

La niche hématopoïétique qui renferme les cellules souches influence la leucémogénèse et
la résistance des cellules souches leucémiques (CSL) aux drogues utilisées en chimiothérapie. Pour
mieux comprendre les interactions entre les différents composants de la niche et proposer de
nouvelles stratégies de traitements des leucémies, il est nécessaire d’isoler chacun des différents
partenaires (cellules souches mésenchymateuse, cellules souches leucémiques…).
L’objectif de notre étude est d’isoler et de caractériser les cellules souches leucémiques
(CSL) dans la Leucémie Aigüe Myéloïde (LAM) et d’étudier le rôle du microenvironnement dans
la résistance de ces CSL aux traitements de chimiothérapie. Pour cela des prélèvements de
donneurs sains et de patients atteints de LAM ont été utilisés. Des tris cellulaires ont été réalisés
avec des marqueurs décrits dans la littérature comme spécifiques des cellules souches leucémiques
de LAM (CD90, CD33 et CD123). Les populations triées ont ensuite été réensemencées pour des
tests fonctionnels pour déterminer le compartiment des progéniteurs leucémiques et celui des CSL.
Le phénotype des progéniteurs leucémiques n’a pas pu être déterminé, par contre les CSL ont été
+ - +retrouvées pour une partie des patients testés dans la fraction de phénotype CD34 CD38 CD123
+ - -tandis que les cellules souches hématopoïétiques saines sont de phénotype CD34 CD38 CD123 .
L’étude moléculaire nous a permis de confirmer la dérégulation de Bmi-1 dans la LAM
mais également d’autres gènes comme par exemple TP73 dont les isoformes sont surexprimées
dans la LAM et notamment dans les LAM M1 et M5.
A partir des premiers résultats obtenus sur les cellules primaires, nous avons pu déterminer
parmi les lignées de LAM à notre disposition deux modèles, les KG1 modèle de progéniteurs
leucémiques et les KG-1a modèle de CSL. Ces modèles nous ont permis d’étudier la réponse aux
drogues de chimiothérapie (daunorubicine et resvératrol) en condition d’adhésion ou non. Nous
nous sommes ensuite intéressé à l’expression des isoformes de TP73 et d’autres gènes en réponse
aux traitements. Les premiers résultats obtenus mettent en évidence une modification de
l’expression des isoformes du gène TP73 en réponse aux traitements. Nous avons également put
observer que l’effet des traitements sur l’expression de isoformes de TP73 peut être modulés par
l’adhésion à la fibronectine.

Mots clefs : Cellule souche leucémique, microenvironnement, TP73



SOMMAIRE

Partie I : Introduction bibliographique

Introduction générale

I. Les cellules souches…………………………………………………………………p.1

a. Généralités
b. Les différents types de cellules souches………………………………………...p.2
c. Auto-renouvellement et division asymétrique…………………………………..p.3
d. La potentialité des cellules souches
e. Caractéristiques des cellules souches…… ……… ……… ……… ……… …….. . p . 4
e.1. Identification des cellules souches
e.2. Caractéristiques moléculaires et biochimiques……………………………..p.6

II. Le modèle hématopoïétique……………………………………………………....p.11

a. Définition et fonction de l’hématopoïèse
b. Origine embryonnaire………………………………………………………….. p.12
c. Les différents compartiments de l’hématopoïèse……………………………… p.13

III. La niche hématopoïétique………………………………………………………….. p.15

a. Localisation et structure physique de la niche hématopoïétique
b. Les deux types de niche hématopoïétique……………………………………... p.17
c. Mécanismes d’action de la niche hématopoïétique……………………………. p.19

IV. Cellule souche et cancer…………………………………………………………… p.23

a. Définition de la cellule souche cancéreuse
b. Mise en évidence des cellules souches cancéreuses…………………………… p.25


V. La Leucémie Aigüe Myéloïde……………………………………………………... p.28

a. Définition
b. Les différents types de LAM et leur classification…………………………….. p.29
c. Les antimitotiques dans le traitement des LAM : principale thérapeutique…… p.30
d. Approche thérapeutique………………………………………………………... p.31
e. Le cas particulier de la LAM promyélocytique : LAM de type 3……………... p.33
f. Les nouvelles molécules en cours d’étude……………………………………... p.34

VI. Les éléments de dérégulation des cellules souches leucémiques dans la LAM…… p.37

a. Phénotype et identification des CSL de LAM
a.1. Indentification par les marqueurs membranaires
a.2. Les autres moyens de caractériser les CSL………………………………………... p.39
b. Mécanismes de résistance des CSL……………………………………………. p.40
c. Rôle de la niche dans la résistance……………………………………………... p.41
d. Dérégulation de la famille p53…………………………………………………. p.43

VII. Objectif de travail………………………………………………………………….. p.45














ABREVIATIONS

Unité :

°C = Degré Celcius % = Pourcentage
µg Microgramme nm =nanomètre
µL = Microlitre ml = Millilitre
h = heure min = Minute
µM = Micromole / Litre mM = milimolaire
mg = Milligramme s = seconde

Abréviations :

ABC = ATP Binding Cassette
ADN = Acide DésoxyriboNucléique
ADNc = Acide Desoxyribo Nucléique complémentaire
ALDH = Aldéhyde Déshydrogénase
ARN = Acide RiboNucléique
ATP = Adénosine Tri Phosphate
BMP = Bone Morphogenetic Protein
BSA=Albumine Sérique Bovine
CD = Cluster Differentiation
CFC = Colony Forming Cell
CS = Cellules Souche
CSC = Cellule Souche Cancéreuse
CSH = Cellule Souche Hématopoïétique
CSL = Cellule Souche Leucémique
CSM = Cellule Souche Mesenchymales
DMSO = Diméthyle Sulfoxyde
DNTP = désoxyNucléotides TriPhosphate
EDTA = acide EthylèneDiamineTétraAcétique
FACS = Fluorescence Activated Cell Sorter
FAK = Focale Adhesion Kinase
FITC = Fluorescein Iso ThioCyanate Fn = Fibronectine
G-CSF = Granulocyte Colony Stimulating Factor
GM-CSF = Granulocyte Macrophage – Cell Stimulating Factor
GSK3  = glycogène synthase kinase 3 beta
Ig = Immunoglobuline
IMDM = Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium
KO = Knock Out
LAM = Leucémie Aiguë Myéloïde
LMC = Leucémie Myéloïde Chronique
LTC-IC = Long Term Cultur Initiating cell
MAPC = Multipotent Adult Progenitor Cells
MEC = Matrice ExtraCellulaire
MNC = Mono Nuclear Cells
NOD / SCID = NonObese Diabetic / Severe Combined ImmunoDeffiscient
PBS = Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline
PCR = Polymerase Chain Reaction
PCRQ = PCR quantitative
RT = Reverse Transcriptase
RPMI = Roswell Park Memorial Institute
RT-PCR = Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
SCID = Severe Combined ImmunoDeffiscient
VEGF= Vascular Endothelial Growth Factor











Introduction générale

L’hématopoïèse est l’ensemble des mécanismes qui sont impliqués dans la fabrication et le
remplacement des cellules sanguines afin de maintenir le renouvellement des cellules et ainsi un
état de bon fonctionnement. Les leu