MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE

Guillaume Marcy

Description

Niveau: Supérieur, Master, Bac+5

• mémoire

MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE MEMOIRE Présenté Par Guillaume MARCY Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Cellules Souches Embryonnaires De Primate : Culture Et Etude du Cycle Cellulaire Soutenu le 29 Novembre 2006 devant le jury suivant : Mme Geneviève CORDIER - Présidente - Mr Jean-Marie EXBRAYAT - Tuteur pédagogique - Mr Bertrand Pain - Examinateur - Mme Colette DEHAY - Tuteur scientifique - Laboratoire Reproduction et Développement des Vertébrés 25, rue du Plat 69288 Lyon Cedex 02 Directeur EPHE : Jean-Marie EXBRAYAT Laboratoire INSERM U371 –Institut cellule souche et cerveau- Equipe Colette DEHAY 18 avenue du Doyen Lépine DIRECTEUR : Henry KENNEDY 69675 Bron cedex RESPONSABLE : Colette DEHAY EPHE Banque de Monographies SVT 1

• embryons pré-implantatoires de souris, de singe et d'homme


• cellule


• recherche préclinique des maladies génétiques et des cancers


• revue générale du cycle cellulaire des cellules somatiques


• primate


• lignées de cellules souches embryonnaires


• cycle cellulaire

Sujets

• Mémoire
• Kennedy
• Exbrayat
• Cellule

Informations

• Publié par: profil-afte-2012
• Publié le: 01 novembre 2006
• Nombre de lectures: 44
• Langue: Français

Extrait

MINISTERE DE L’EDUCATION NATIONALE

ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES

SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE



MEMOIRE

Présenté

Par Guillaume MARCY

Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes



Cellules Souches Embryonnaires De Primate :
Culture Et Etude du Cycle Cellulaire





Soutenu le 29 Novembre 2006 devant le jury suivant :

Mme Geneviève CORDIER - Présidente -
Mr Jean-Marie EXBRAYAT - Tuteur pédagogique -
Mr Bertrand Pain - Examinateur -
Mme Colette DEHAY - Tuteur scientifique -





Laboratoire Reproduction et Développement des Vertébrés
25, rue du Plat
69288 Lyon Cedex 02 Directeur EPHE : Jean-Marie EXBRAYAT
[e-mail]


Laboratoire INSERM U371 –Institut cellule souche et cerveau-
Equipe Colette DEHAY
18 avenue du Doyen Lépine DIRECTEUR : Henry KENNEDY
69675 Bron cedex RESPONSABLE : Colette DEHAY
[e-mail]

EPHE Banque de Monographies SVT 1ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES
SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE

CELLULES SOUCHES EMBRYONNAIRES DE PRIMATE : CULTURE
ET ETUDE DU CYCLE CELLULAIRE

PAR GUILLAUME MARCY

SOUTENU LE 29 Novembre 2006

Des lignées de cellules souches embryonnaires (cellules ES) ont été isolées à partir
d’embryons pré-implantatoires de souris, de singe et d’homme. Les cellules ES de ces trois espèces
ont la capacité de s’autorenouveller indéfiniment in vitro tout en conservant les propriétés de
pluripotence leur permettant de se différencier dans tous les types cellulaires. Autorenouvellement
illimité et pluripotence font des cellules ES un candidat idéal pour le développement de nouveaux
outils de thérapie cellulaire.
L’objectif du projet de recherche décrit dans ce mémoire a été (i) d’optimiser les conditions de
culture des cellules ES de primate afin d'obtenir facilement de grandes quantités de cellules à l'état
indifférencié/pluripotent et (ii) de caractériser les propriétés du cycle cellulaire des cellules ES de
singe rhésus. En effet, le cycle des cellules ES de souris diffère radicalement de celui des cellules
somatiques à de nombreux égards (revue dans Savatier et al., 2002). Il semble que ces caractéristiques
atypiques du cycle cellulaire permettent aux cellules ES de maintenir leurs propriétés
d’autorenouvellement et de pluripotence. Le cycle cellulaire des cellules ES de primate n’ayant jamais
été décrit, nous avons donc entrepris de déterminer dans quelle mesure les propriétés observées dans
les cellules ES de souris sont conservées chez le primate. Ce projet s’inscrit dans le contexte des
travaux de l’unité, qui visent le développement et la validation préclinique de stratégies de thérapie
cellulaire, basées sur l'utilisation des cellules ES de primate pour le traitement de la maladie de
Parkinson.
Par l’utilisation de mesures de cytométrie en flux combinées avec des analyses quantitatives
de la cinétique du cycle cellulaire, nous avons montré que les cellules ES de singe rhésus sont
caractérisés par une progression extrêmement rapide de la phase G1, qui correspond à 15% de la
durée totale du cycle. Les cellules ES de singe présentent une expression de la cycline E détectée
dans toutes les phases du cycle cellulaire, et ne s’arrêtent pas en G1 après une irradiation-g, reflétant
l’absence de point de contrôle en G1. La privation de sérum ou l’inhibition pharmacologique des
kinases MEK n’entraînent pas d’altération de la distribution cellulaire dans le cycle, indiquant que la
croissance des cellules ES de primate ne nécessite pas de signaux mitogènes transduits par la voie
Ras/Raf/MEK. Pris ensemble, ces résultats indiquent que les cellules ES de singe rhésus, comme les
cellules ES de souris, possèdent des caractéristiques inhabituelles de cycle cellulaire dans lequel les
contrôles des mécanismes opérant pendant la phase G1 sont réduits ou absents.


Mots clés : cellules ES de primate ; autorenouvellement ; pluripotence ; conditions de culture ; cycle
cellulaire.


SOMMAIRE

ABREVIATIONS....................................................................... 6

EPHE Banque de Monographies SVT 2INTRODUCTION....................................................................... 7

RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES...................................................... 8

1. Définition et applications en clinique et en recherche des cellules ES....... 8
1.1 Définition.................................................................................. 8
1.2 Cellules ES : applications cliniques et recherche............................ 8
1.2.1 Etude génomique........................................................................................ 8 1.2.2 Etude des processus biologiques................................................................ 9
1.2.3 Recherche préclinique des maladies génétiques et des cancers.................. 9 1.2.4 Thérapie cellulaire...................................................................................... 9
1.2.5 Recherche pharmaceutique....................................................................... 10 1.2.6 Transfert nucléaire................................................................................... 10

2. Dérivation des cellules ES...................................................... 11

3. Propriétés des cellules ES 12
3.1 Autorenouvellement.................................................................. 12
3.2 Pluripotence............................................................................. 12
3.3 Caryotype................................................................................ 13
3.4 Distinction entre les cellules ES et les cellules souches de l’embryon 14

4. Facteurs intrinsèques de l’autorenouvellement et les marqueurs de pluripotence dans les
cellules ES 14
4.1 Marqueurs de surface................................................................ 14
4.2 Oct-4...................................................................................... 15
4.2.1 Co-facteurs de Oct-4............................................................................... 15
4.2.2 Gènes cibles de Oct-4 16
4.3 Nanog 17
4.4 Autres facteurs......................................................................... 18
4.4 Activité télomérase................................................................... 18
4.5 Activité phosphatase alcaline.................................................... 19

5. Facteurs extrinsèques de l’autorenouvellement et de la pluripotence dans les cellules ES 19
5.1 Voie LIF/gp130/STAT3............................................................... 19
5.2 Voie des TGFβ............................................................................. 21
5.2.1 TGF β/Nodal/activine................................................................................ 21
5.2.2 BMP......................................................................................................... 23
5.3 Voie FGF et PI3K....................................................................... 25
5.4 Voie canonique Wnt/ β-caténine.................................................. 26
EPHE Banque de Monographies SVT 3
6. Optimisation des conditions pour la culture des cellules ES humaines.... 27
6.1 Optimisation des conditions de culture afin d’obtenir des populations pures de
cellules ES humaines 27
6.2 Matrices extracellulaires et substrats......................................... 28
6.3 Milieux de culture..................................................................... 28
6.4 Passages.................................................................................. 29
6.5 Optimisation des conditions afin d’utiliser les cellules ES en thérapie cellulaire 30
6.6 Modifications génétiques des cellules ES..................................... 31
6.6.1 Transfections transitoires et stables........................................................ 31
6.6.2 Vecteurs viraux : système lentiviraux...................................................... 32

7. Cycle cellulaire des cellules somatiques et des cellules ES................. 33
7.1 Revue générale du cycle cellulaire des cellules somatiques........... 33
7.1.1 Introduct