Sequencage :Electrophorèse sur capillaires

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Extrait

Description

rapport de stage

excitation par le faisceau laser
réaction de séquence
ddntp
système de transfert d'énergie par résonance
adn polymérase
adn-polymérase
capillaires
fluorescence spécifique
fluorescence
brin
migrations
migration

Sujets

ACTIVITE
Extrait du rapport de Stage de Séverine ESCAICH
SOMMAIRE
I. RÉACTION DE SÉQUENCE.................................................................................................2
I1. Principe de la méthode de SANGER ......................................................................2
I2. Adaptation de la technique à la fluorescence.........................................................3
I3. Conditions techniques ............................................................................................5
I4. Thermocyclage........................................................................................................6
I5. Purification de la réaction de séquence par sephadex G50...................................6
II. DÉTERMINATION DE LA SÉQUENCE DU BRIN MATRICE .....................................................7
II1. Principe du fonctionnement de l’appareil..............................................................7
II2. Fonctionnement de l’appareil ................................................................................7
II2a. Présentation de l’analyseur génétique 3100 .......................................................8
II2b. Déroulement d’un run.........................................................................................8
II2c. Collection des données par le logiciel DATA COLLECTION (ABI). ............10
II2d. Calibration spatiale...........................................................................................13
II2e. Calibration spectrale13
II2f. Analyse des données brutes par le logiciel DATA ANALYSIS (ABI) ...........15
II2g. Entretien de l’appareil ......................................................................................15I. REACTION DE SEQUENCE
La réaction de séquence que l’on utilise au laboratoire repose sur la méthode de SANGER ou
méthode des interrupteurs de chaîne, adaptée a la fluorescence.
I1. Principe de la méthode de SANGER
Le recopiage d’un brin matrice par une ADN polymérase ADN dépendante est initiée par la
fixation d’un oligonucléotide spécifique (amorce), complémentaire du brin matrice. Cette
ADN polymérase va permettre l’élongation d’un nouveau brin complémentaire du brin
matrice dans le sens 5’ 3’ (cf schéma p13)
L’ADN polymérase permet l’incorporation de nucléotides (dNTP: déoxynucléotides) libres
présents dans le milieu réactionnel par la formation d’un pont phosphodiester entre le 3’OH
de la chaîne et le 5’ phosphate du dNTP suivant.
La réaction de Sanger repose sur l’incorporation alléatoire par cette ADN polymérase de
didéoxynucléotides interrupteurs de chaîne (ddNTP) eux aussi présents dans le milieu
réactionnel.
Ces ddNTP diffèrent des dNTP par leur extrémité 3’. L’extrémité 3’OH des dNTP est
remplacée par une extrémité 3’H. Cette modification empêche la formation de la liaison
phosphodiester entre le ddNTP incorporé dans la chaîne et le nucléotide suivant.
L’allongement de la chaîne est alors interrompu.
Dans le milieu réactionnel il y a compétition entre les dNTP et les ddNTP. Le rapport
spécifique ddNTP/dNTP et l’affinité de la taq pour chaque nucléotide sont optimisés de telle
façon qu’un ddNTP soit statistiquement incorporé à toutes les positions possibles.
Une migration électrophorétique du produit de cette réaction de séquence sur un gel très
résolutif (polyacrylamide) va séparer tous les fragments présents en fonction de leur masse
moléculaire(taille).
Les plus petits fragments vont migrer plus rapidement que les grands. La grande résolution de
ce gel permet de distinguer des fragments différents entre eux d’une paire de base.
L’identification du ddNTP présent à l’extrémité 3’ de chaque fragment déterminera la
séquence nucléotidique du brin matrice initial.
___________________________________________________________________________
2I2. Adaptation de la technique à la fluorescence
L’élongation de chaque produit monobrin se termine par l’incorporation d’un ddNTP
spécifique (voir schéma p13 ).
Ici, chaque ddNTP (ddATP,ddTTP,ddCTP,ddGTP) est marqué par un fluorochrome différent
dont le spectre d’émission est spécifique. Une analyse spectrale va différencier les différents
fluorochromes, associer la base correspondante et donc définir la séquence nucléotidique du
brin d’ADN initial.
Nous utilisons la technologie Big Dye Terminatorversion2 (Applied Biosystems : ABI),
version 2.

La technologie Big Dye Terminator (BDT) utilise un système de transfert d’énergie par
résonance (FRET) entre deux fluorochromes fixés sur le même ddNTP et reliés entre eux par
un linker. Le premier est une fluorescéine (6 carboxyfluoréscéine) appelé fluorochrome
donneur, commun aux quatre ddNTP. Le second est une dichlororhodamine (dRhodamine)
qui joue le rôle de fluorochrome accepteur.
Le fluorochrome donneur est excité par un rayon laser à argon émettant à 488nm et 514,5nm.
Son énergie de fluorescence émise (515-520nm) est captée intégralement par le fluorochrome
accepteur qui est excité à son tour. Le fluorochrome accepteur ou dichloroRhodamine est
différent pour chaque type de ddNTP.
ddNTP dichloroRhodamines Spectre d’émission
utilisées maximum
A dR6G 560-565nm
T dROX 615-620nm
C dR110 530-535nm
G dTAMRA 590-595nm
Le spectre de la fluorescence réémise sera ainsi spécifique de chaque type de ddNTP. Le
transfert du signal de la fluorescéine vers la dRhodamine permet une amplification du signal
et, par conséquent, une augmentation de la sensibilité de la technique(fig1).
Fluorescéine : fluorochrome donneur
commun à tous les dNTP
Dichlororhodamine : fluorochrome
accepteur, spécifique du ddNTP
FRET
Laser
d’excitation Fluorescence émise
ddNTP
Fig 1 : Mécanisme de la fluorescence par la technique du transfert d’énergie par résonance
___________________________________________________________________________
3Etapes de la réaction de séquence

5’ 3’
T A C TT C A G C G T A C A
A T G AA G T C G C A T G T
3’ 5’
. Dénaturation de l’ADN double brin
5’ 3’
T A C TT C A G C G T A C A
A T G AA G T C G C A T G T
3’ 5’
Hybridation entre l’amorce et1 Cycle
le brin matrice
5’ 3’
+T A C
A T G AA G T C G C A T G T
3’ 5’
Fixation de la Taq polymérase et
alongement de la molécule d’ADN
par incorporation de dntp.
3’5’ F
T A C TT C
A T G AA G T C G C A T G T
3’ 5’
F5’ 3’
T
5’ 3’F
T A
5’ 3’F
T A C
5’ 3’F
T A C T
3’F5’
T A C TT
5’ F 3’
T A C TT C
5’ F 3’
T A C TT C A
Le brin allongé se termine par incorporation 5’ F 3’
d’un didéoxynucléotide marqué par un T A C TT C A G
fluorochrome différent selon la base présente F5’ 3’
(A,T,C ou G ). T A C TT C A G C
Au bout de 30 cycles on obtient un pool F5’ 3’
T A C TT C A G C Gd’ADN simple brins de taille croissante.
F5’ 3’
T A C TT C A G C G T
F5’ 3’
T A C TT C A G C G T A
___________________________________________________________________________
4L’adaptation de la technique de Sanger à la fluorescence permet d’effectuer la réaction de
séquence dans un tube unique.
Nous utilisons depuis peu de temps le Kit DYEnamic ET Terminator (Amersham) qui utilise
une chimie proche du kit BDT V2 (Technologie FRET). Sa spécificité est l’utilisation d’une
polymérase différente (la Thermo-Sequenase II) et de fluorochromes différents.
I3. Conditions techniques

L’ADN polymérase utilisée dans le kit BDT est la Taq polymérase FS (ABI). Celle utilisée
dans le kit Amersham est la Thermo-Sequenase.
Ces enzymes sont thermorésistantes et permettent d’effectuer plusieurs cycles d’élongation
successifs. Par conséquent la matrice d’ADN peut être réutilisée plusieurs fois et donc être
présente en quantité plus réduite. Cela permet une amplification linéaire du signal. De plus
l’utilisation de fortes températures pour la dénaturation de la matrice aide à déstabiliser
d’éventuelles structures secondaires.
La Taq FS est modifiée génétiquement pour le séquençage (Taq FS pour Fluorescent
Sequencing).
Elle possède une première mutation au sein de son site actif qui facilite l’incorporation des
ddNTP par rapport aux dNTP.
La seconde mutation se situe au niveau de son domaine amino-terminal pour éliminer son
activité exonucléasique 5’ 3’.
La thermo-Sequenase est également dédiée à l’activité de séquence. Elle se caractérise par
une très forte processivité.
Les nucléotides utilisés classiquement