Université Louis PASTEUR de STRASBOURG

François Debaene

Description

Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
Université Louis PASTEUR de STRASBOURG U.F.R. de SCIENCES CHIMIQUES THÈSE Présentée pour obtenir le grade de DOCTEUR de l'UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR de STRASBOURG par François DEBAENE ” MICROPUCES A PETITES MOLÉCULES : NOUVEL OUTIL PROTÉOMIQUE POUR PROFILER L'ACTIVITÉ ENZYMATIQUE ” Soutenue publiquement le 10 février 2007 devant la commission d'examen : Pr. K. JOHNSSON Rapporteur externe Dr. Ch. BREVARD Rapporteur externe Pr. A. GRIFFITHS Rapporteur interne Pr. J.-M LEHN Examinateur Pr. N. WINSSINGER Directeur de thèse

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Sujets

• Louis Pasteur University
• Has Been
• Enzyme

Informations

• Publié par: profil-zyak-2012
• Publié le: 01 février 2007
• Nombre de lectures: 29
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 9 Mo

Extrait

Université Louis PASTEUR de STRASBOURG
U.F.R. de SCIENCES CHIMIQUES
THÈSE
Présentée pour obtenir le grade de
DOCTEUR de l’UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR
de STRASBOURG
par
François DEBAENE

” MICROPUCES A PETITES MOLÉCULES :
NOUVEL OUTIL PROTÉOMIQUE POUR PROFILER
L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE ”

Soutenue publiquement le 10 février 2007 devant la commission d’examen :

Pr. K. JOHNSSON Rapporteur externe
Dr. Ch. BREVARD
Pr. A. GRIFFITHS Rapporteur interne
Pr. J.-M LEHN Examinateur
Pr. N. WINSSINGER Directeur de thèse II” MICROPUCES A PETITES MOLÉCULES :
NOUVEL OUTIL PROTÉOMIQUE POUR PROFILER
L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE ”


François DEBAENE
Février 2007
III IVAbstract


Microarray has become an indispensable technology in postgenomic research area. By
its highly miniaturization format, it allows for high throughput screening of several thousand
analytes in few microliter volumes. A number of strategies have been developed to
immobilize small molecules or antibodies on this format for drug discovery or for diagnostic
tool.
The peptide nucleic acid (PNA)-encoded small molecule library strategy allows for
combinatorial libraries synthesize in a split and mix format to be organized into microarray by
a self-sorting assembly. This methodology enables enzyme activity screening without a priori
knowledge of the target in complex mixture such as crude cell lysates.
Peptide and PNA chemistries were developed to synthesize and screen on a microarray
format three generations of PNA-encoded inhibitor libraries targeting several protease
families. Those libraries are presenting 625 to 4000 mechanism based inhibitors individually
labelled with a PNA sequences that encodes the structure of a tetrapeptide inhibitor, as well as
its specific localisation onto a microarray.
Substantial efforts on optimizing microarray spotting as well as signal detection and
hybridization conditions presented in this thesis gives to PNA-encoded strategy a sensitive
and specific format to quantify enzymatic activities and identify substrate specificities.
The PNA-encoded methodology strategy has been validated by profiling enzyme
activity from allergenic dustmite extract as well as to detect substrate specificities of purified
enzyme samples. Identified inhibitors showed on one hand to be specific enough to decipher
closely related activities of enzyme belonging to the same family, and, on the other hand, to
identify the inhibitor’s target enzyme by affinity column coupled to mass spectrometry.
Finally, identified inhibitors can be used to knock down the activity of an enzyme and
evaluate its correlation to a phenotype.
This strategy is to date the only functional methodology that enable to profile enzyme
activity with inhibitors in a miniaturized format.

V VIRemerciements

Durant ces quatre années de thèse, de nombreuses personnes m’ont accompagné, écouté,
soutenu, supporté et je souhaiterais les remercier.

Je tiens tout d’abord à remercier le Pr. Nicolas Winssinger pour m’avoir accueilli au
sein de son équipe. Je le remercie de m’avoir fait confiance pour mener à bien un tel projet de
recherche, pour son enthousiasme, sa disponibilité, ses conseils et de manière plus générale,
de m’avoir appris la chimie dans des conditions exceptionnelles.
Je souhaite également remercier le Dr. Sofia Barluenga, bras droit irremplaçable de
l’équipe, pour tous les précieux conseils qu’elle m’a donné ainsi que sa joie de vivre.
Félicitation encore pour Patricia, elle est magnifique.
Je remercie très sincèrement le Pr. Lehn, Pr. Griffiths, Pr Johnsson et Dr. Brevard pour
avoir accepté de se pencher sur le travail décrit dans ce manuscrit. C’est un très grand honneur
pour moi d’avoir pu vous réunir autour de ce projet.
Merci à la région Alsace de m’avoir financé à moitié durant trois années
Un grand merci aux collègues impliqués dans ce même projet, Julien Da Silva,
Zbigniew Pianovski, Fernando Duran et Srinivasu Pothukanuri sans quoi peu de chose aurait
été possible. De la même manière, merci à tous les autres membres du labo, particulièrement
Emilie, Pierre-Yves, Mehdi, Domingo Kuo-Ting et Cuihua ainsi que les membres passés :
Pili, Domingo, Nasser, Alexandro, Lucia, Lise, Kerstin, Lorenzo et Niels. Un grand merci
aussi à Laurence Oswald pour son aide technique et Corinne et Sylvie pour leurs dons à
résoudre des problèmes administratifs. C’était vraiment un très grand plaisir d’avoir bossé
avec vous, de s’être tenu les coudes dans toutes situations, quatre années, ce n’est pas rien, et
je suis heureux de les avoir passées avec vous. Grand merci à vous. Au commencement de
cette grande aventure, il n’y avait que Nicolas, Sofia, Pili et moi, nous sommes actuellement
seize… Désolé encore pour mes coups de stress, mais j’espère vous avoir donné le meilleur
de moi-même tant au niveau professionnel qu’humain.
Merci à toute les personnes d’ISIS qui ont contribué à faire de ce centre de recherche
ce qu’il est aujourd’hui. C’est un privilège de travailler dans de telles conditions et dans un
environnement si multidisciplinaire.
Je remercie profondément le Dr. Jennifer Harris de l’accueil chaleureux au sein de son
équipe au Scripps/GNF lors de mon séjour de six mois à San Diego. Merci aux membres de
VIIson équipe et principalement à Hugo, Julie-anne, et Ray. Merci encore à Nicolas de m’avoir
proposé une telle opportunité. C’était une expérience unique pour moi et enrichissante à tout
point de vue.
Encore un merci, mais pas des moindres, revient à l’équipe de la plateforme de
microarray de l’IGBMC et notamment Bernard Jost et Christine, sans quoi ce projet n’aurait
pas été possible. Bernard, c’était très enrichissant de travailler avec toi.
Merci à tous les gens que j’ai côtoyé à ISIS pour leur sympathie et leur disponibilité
(Jean-Louis, Nicolas, Jacline, Yves, Thierry, Fabien, Fabienne…tous).
Un re-merci à Christian de m’avoir expliqué la transformée de Fourier et l’alignement
des spins il y a maintenant 10 ans.
Une pensée au Dr. Brais et Dr. Rochette-Egly qui m’ont transmis leur passion pour la
recherche et qui m’ont accueilli dans leur labo.
Un doctorat, c’est un investissement personnel énorme. Sans le soutien de mes amis et
de ma famille, rien n’aurait été possible. Mes pensées vont bien évidement tout d’abord à mes
parents, mon frère et ma sœur qui m’ont toujours soutenu, surtout dans les périodes les plus
difficiles ; à ma grand-mère, mon filleul Matthieu, mes cousins. Je remercie encore Marie,
qui a supporté mes horaires de thésard et mes humeurs de tous les jours, ainsi que mes amis
qui représentent énormément pour moi Tom, Marco, Henri, Franck, Oli, Riad, Steevx, GG,
Farid, David, Virginie, FX, Mathilde, Anne, Alex, Sophie, Lyse, Cécile, Sven, Laurence, Fab,
Nico, Alexay, Smain, Djul, Emilie et j’en oublie, bref, avec tous les gens avec lesquels j’ai
grandi et évolué.

Merci à toutes et à tous




Ce mémoire de Thèse est dédié à mes parents qui m’ont toujours encouragé à aller de l’avant,
quelle que soit la situation, à ne jamais baisser les bras.

VIIIRésumé détaillé

Depuis la publication du génome de nombreux organismes, d'importantes recherches
sont menées afin de décrypter et de comprendre la fonction de nombreux gènes, ainsi que des
protéines correspondantes. Sur le plan génomique, le profilage d'expression d'ARNm s'est
avéré être un outil puissant pour répondre à ces questions. Au niveau protéomique, des
méthodes de séparation comme les gels bidimensionnels, combinées à la spectroscopie de
masse, sont reconnues comme étant les approches les plus efficaces. D’un point de vue
fonctionnel, certaines techniques tels que des criblages doubles hybrides ont permis la
détection d’interaction protéine-protéine au niveau cellulaire. Malgré le succès de ces
méthodes, il est important de se rappeler que la fonction des protéines est souvent, et de
manière très importante, régulée de manière post-traductionnelle. En effet, la capacité des
cellules à réguler la fonction des protéines de manière rapide et réversible est essentielle à leur
survie. L’activation des protéines cellulaires peut également être modulée par leur
environnement, ainsi que par les interactions qu’elles effectuent avec d’autres protéines.
Ainsi, une méthode permettant de mesurer la fonctionnalité ou l'