ETUDE DE LA DYNAMIQUE CELLULAIRE DE LA PROTEINE MDR1 PAR LA TECHNIQUE DE FRAP

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• Publié par: Fuwyang
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Extrait

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ETUDE DE LA DYNAMIQUE CELLULAIRE DE
LA PROTEINE MDR1 PAR LA TECHNIQUE DE
FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)
Tuteur Tounsia Aït-Slimane-
Maud Dachy, François Ten Ket Kian, Fanny MorlentDachy Ket „
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Plan
Introduction
1 Description de la protéine MDR1 (multidrug-resistance )
2 Rôle et intérêt de la protéine MDR1 en physiopathologie
3 Trafic intracellulaire de la protéine MDR1
4 MDR1 et les microdomaines lipidiqueslipidiques
Objectif du projet
Démarche expérimentale
1 Expression de la protéine de fusion MDR1-GFP dans les cellules
hépatiques
2 La technique de FRAP
Résultats attendus„
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Description de la protéine MDR1
MDR1 est le produit d’un gène du chromosome 7
2 séquences homologues composées de 6 domaines transmembranaires
Appartient à la famille des transporteurs ABC
Protéine ubiquitaire
Fortement exprimée dans les cellules endothéliales et épithéliales (à la
surface apicale) et à la surface cellulaire dans plusieurs tumeurs
Responsable de la résistance phénotypique de certains médicaments et de la
résistance de certaines cellules cancéreuses à la chimiothérapie
Intervient dans la translocation de certains glycosphingolipides
(glucosylcéramide) ) „
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Rôle et intérêt de MDR1 en
physiopathologie
La protéine MDR1 assure le transport membranaire
d'environ quarante médicaments (immunosuppresseurs,
des hormones stéroïdiennes, des inhibiteurs calciques, ou
encore des antiprotéases ) )
Responsable de la résistance phénotypique de certains
médicaments, elle peut ainsi moduler leurs
concentrations plasmatiques ou intracellulaires et
influencer la réponse au traitement
MDR1 intervient dans de nombreuses maladies: Sida,
Tumeur épithéliale rénale (résistance à la
chimiothérapie), Alzheimer, Maladie de Parkinson,
Maladie inflammatoire intestinale„
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Trafic intracellulaire de la protéine MDR1 dans
l’hépatocyte
Voie indirecte (la transcytose) : les
Pn-GPI
protéines GPI et transmembranaires
Pn-TM
sont adressées d’abord vers la
membrane basolatérale puis puis
redirigées au canalicule biliaire
Bsep
BC
MDR1
Voie directe: les protéines à plusieurs
domaines transmembranaires sont
TJ
adressées directement du réseau
MRP1
trans-golgien vers le canalicule
biliaire
BL„
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MDR1 et les microdomaines lipidiques
(Rafts)
Microdomaine de type Raft
Microdomaines riches
en glycosphingolipides et
en
GSL GPI
cholestérol
TM
Ils permettent le transfert
de protéines spécifiques
vers la membrane
Chol
résistants à la
solubilisation à froid par
certains détergents
1
Lubrol WX
(triton, lubrol, Brij…) 2…)
3
12 45 7 9 11 12
4 insoluble (raft)
3 6 8 10
MDR1 est associée aux
5
6
microdomaines
7
8
insolubles dans le Lubrol
9
Soluble (non-raft)
10
11
12Objectif du projet
Mieux comprendre l’interaction de la protéine ’éine
MDR1 avec les microdomaines lipidiques en
étudiant sa dynamique directement sur cellules
vivantes
GFP
MDR1-GFP
Transfection de MDR1-GFP dans les cellules hépatiquesLa technique de FRAP (Fluorescence
Recovery After Photobleaching))
1. Extinction localisée
1.
(photoblanchiment) de la
fluorescence
2. Mesure de la
2.
réapparition de la
fluorescence dans la
zone éteinte
3.3. Calcul du coefficient de
diffusion et du % de la
fraction mobileLa microscopie biphotonique permet de faire
un photoblanchiment localisé
Microscopie
Microscopie classique
biphotonique
(1 photon)
1-2
µm
cytosol cytosolModèles proposés pour expliquer la é
dynamique des protéines associées aux
rafts
ProtéinesProtéines fortement associées aux rafts aux rafts Protéines fortement associt associées
Faible coefficient de diffusion Toutes les protéines ont le même
coefficient de diffusion
Protéines incorporées dans un même
Diffusion indépendantes des autres antes des autres
microdomaine ont des coefficients de protéines
diffusion qui leur sont propreo