A novel regulatory system for tightly controlled and long-term inducible transgene expression in human cell lines [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Christina Danke

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• Publié par: friedrich-alexander-universitat_erlangen-nurnberg
• Publié le: 01 janvier 2010
• Nombre de lectures: 27
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 11 Mo

Extrait

A novel regulatory system
for tightly controlled and long-term inducible
transgene expression in human cell lines



















Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.




vorgelegt von
Christina Danke
aus Forchheim










Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg























Tag der mündlichen Prüfung: 12. April 2010

Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch

Erstberichterstatter: Prof. Dr. Wolfgang Hillen

Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Hans-Martin Jäck

Danksagung



Prof. Dr. Wolfgang Hillen danke ich für die Möglichkeit, an seinem Lehrstuhl zu promovieren,
seine langjährige Unterstützung und seinen wissenschaftlichen Rat.

Prof. Dr. Hans-Martin Jäck möchte ich für die Erstellung des Zweitgutachtens danken.

Prof. Dr. Christian Koch und Prof. Dr. Lars Nitschke danke ich für ihre Bemühungen als
Zweitprüfer.

Mein besonderer Dank geht an Dr. Christian Berens für seine umfassende Betreuung, seine stets
offene Tür bei sämtlichen Anliegen, seine Anregungen und das kritische Lesen der Arbeit.

Gedankt sei Prof. Dr. Georg Fey und Prof. Dr. Lars Nitschke für die Zurverfügungstellung des
FACSCalibur und den Mitgliedern des Lehrstuhls für Genetik für ihre Hilfsbereitschaft bei
Problemen und Fragen rund um das Gerät, sowie für CD123 Antikörper und Molm-13 Zellen.

Prof. Dr. Helmut Fickenscher und Tuna Toptan möchte ich für die interessante Zusammenarbeit
danken.


Ganz besonders danke ich den ehemaligen, momentanen, kurzzeitigen und wieder
zurückgekehrten „Kellerkindern“ für eine tolle Laborgemeinschaft und Zusammenarbeit: Lars
für den gemeinsamen Start in das „Projekt Apoptose“ und die Betreuung in der ersten Zeit,
Christel für zahlreiche Ratschläge in verschiedensten Lebenslagen, Schmidti für schaurig-schöne
Klänge und seine extrem hilfreiche Unterstützung an Bench und Hood, Sabine für die gute
Zusammenarbeit und langjährige Officenachbarschaft, Marcus für chemischen Rat und tolle
Fotografien, den Praktikantinnen Martina, Julia („die Hauptpraktikantin“), Michele und Judith
für ihre Beiträge zu meiner Arbeit, sowie allen zusammen, auch Max, Janko, Anna und Xandra,
für zahlreiche gemeinsame Mittagessen und das eine oder andere gemeinsame Bierchen.

Vielen Dank allen Mitgliedern der Mibi für die angenehme Zusammenarbeit, vor allem den
CvDs, Markus Müller, Dr. Alfons Rösch, Dr. Gerald Seidel und den Damen im Sekretariat.
Kathrin, Britta und Matze danke ich herzlich für ihre Hilfe bei der Inbetriebnahme des Mac in
der „feindlichen“ Netzwerkumgebung.


Besonderer Dank geht an meine Eltern für ihre Rundum-Unterstützung zu jeder (Tages-)Zeit und
an die Familie Hecht für die nachmittägliche Kinderbetreuung und sonstige gemeinsame
Aktivitäten – ohne Euch wäre es zwischendurch ganz schön eng geworden!
Meinen Freunden danke ich für ihre Unterstützung in verschiedensten Situationen und ein stets
offenes Ohr.

Alberto und Layra danke ich dafür, dass sie jahrelang nicht nur die Wochenendplanung den
Bedürfnissen der Zellen untergeordnet haben – ihr seid wirklich toll!


Index
1 Zusammenfassung.................................................................................................................1
2 Summary ................................................................................................................................3
3 Introduction ...........................................................................................................................5
3.1 The Tet system........................................................................................................................... 5
3.1.1 The original eukaryotic Tet system ........................................................................................ 6
3.1.2 Modifications of the Tet system ............................................................................................. 6
3.1.2.1 Transactivator modifications ....................................................................................................... 6
3.1.2.2 Tet transsilencers and the combined activator-repressor strategy................................................ 7
3.1.2.2.1 The generation of tTS-KRAB ................................................................................................. 7
3.1.2.2.2 The combined activator-repressor strategy ............................................................................. 8
3.1.2.2.3 The generation of tTS-PP........................................................................................................ 9
3.1.2.3 Modifications of TRE.................................................................................................................. 9
3.2 Constitutive coexpression of Tet transregulators................................................................. 10
3.3 Conditional expression of suicide genes................................................................................ 11
3.3.1 Conditional cell death as safety tool for therapeutical use ................................................... 11
3.3.2 Conditional cell death elicited by overexpression of proapoptotic proteins......................... 12
3.3.3 Transfer of Tet-dependent expression units into primary cells via rhadinoviral vectors ..... 14
3.4 Scope of the thesis ................................................................................................................... 15
4 Results .................................................................................................................................17
S D
4.1 Jurkat-derived regulator cell lines expressing rtTA2 -M2 and tTS -KRAB .................... 17
S4.1.1 Generation of the regulator cell line Jr2 M2K ..................................................................... 17
S4.1.2 Generation of the regulator cell line Jr2 M2K-LucEGFP .................................................... 19
4.2 Identification of potent suicide genes in Jurkat cells ........................................................... 22
S
4.3 Attempts to establish stable suicide switches in Jr2 M2K cells .......................................... 26
4.4 Control of functional elements used to generate stably integrated suicide switches......... 27
4.4.1 Long-term expression of the tricistronic regulator cassette.................................................. 27
S
4.4.1.1 Long-term regulatory properties of Jr2 M2K cells.................................................................... 28
4.4.1.2 Insulation of the tricistronic regulator cassette by cHS4 core elements..................................... 30
4.4.2 Functionality of cHS4 core elements.................................................................................... 32
4.4.3 Influence of an external promoter on the uninduced activity of an insulated
TRE-controlled expression cassette...................................................................................... 36
S4.4.4 Generation of the control cell line Jr2 M2K-TRE-EGFP..................................................... 37
4.5 The PLDLS motif as an alternative to the KRAB repression domain ............................... 39
S4.5.1 Generation and characterization of the Jurkat regulator cell line Jr2 M2PP........................ 39
S4.5.2 Long-term regulatory properties of Jr2 M2PP cells............................................................. 42
S S4.5.3 Comparison of double stable Jr2 M2K- and Jr2 M2PP-derived cell pools ......................... 43
4.5.3.1 Generation and characterization of double stable Jurkat cell pools coding for different
combinations of transregulators and Tet-inducible promoters................................................... 44
4.5.3.2 Treatment of double stable Jurkat cell pools with 5-AzadC ...................................................... 50
4.6 Comparison of different Tet-inducible promoters in Jurkat T cells.................................. 51
4.6.1 Performance of transiently transfected Tet-inducible reporter constructs............................ 51
S4.6.2 Performance of chromosomally integrated Tet-inducible promoters in Jr2 M2PP cells ..... 52
Index
S4.6.3 Regulatory properties of Jr2 M2PP-MMTV/TRE, -TREtight and -SG/TRE single-cell
clones............................................................................................................................