Analysis of human antigen-experienced CD4 T cells according to IL7Rα [IL7Ralpha] and CCR7 expression [Elektronische Ressource] / von Laura Lozza

Laura Lozza

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• Publié par: humboldt-universitat_zu_berlin
• Publié le: 01 janvier 2009
• Nombre de lectures: 40
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 2 Mo

Extrait

DISSERTATION 
 
ANALYSIS OF HUMAN ANTIGEN‐EXPERIENCED  
CD4 T CELLS ACCORDING TO IL7Rα and CCR7 
EXPRESSION 
 
zur Erlangung des akademischen Grades 
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) 
 
im Fach Biologie 
 
eingereicht an der 
Mathematisch‐Naturwissenschaftlichen Fakultät I 
der Humboldt‐Universität zu Berlin 
 
von 
Diplom‐Biologin Laura Lozza 
geb. am 14.02.1976 in Varese (Italien) 
 
 
Präsident der Humboldt‐Universität zu Berlin 
Prof. Dr. Dr. h.c. Christoph Markschies 
 
Dekan der Mathematisch‐Naturwissenschaftlichen Fakultät I 
Prof. Dr. Lutz‐Helmut Schön 
 
 
 
Gutachter: 
1. ..Prof. Dr. Alf Hamann...................................... 
2.  Dr. Andreas Radbruch...................................... 
3. ..Dr. Michal Or‐Guil...................................... 
 
Tag der mündlichen Prüfung: .16.06.2009............... 
 
 
 

 
2 
  
 
 
 
a nonno Renzo 
3  
  
 
4 
  
 
 
 
 
INDEX 
5  
  
6 
 Index 
 
1  INTRODUCTION ..............................................................................................................11 
1.1  General introduction to the immune system and T cell biology....................................13 
1.2  Role of chemokine receptors in regulating T cell traffic................................................15 
1.2.1  CCR7 as a key factor to enter the secondary lymphoid organs.............................16 
1.2.2  Chemokine receptor expression reflects the functions of T cells..........................17 
1.3  Definition of memory T cell subsets: T , T  and T  cells........................................19 CM EM EMRA
1.3.1  Heterogeneity of human T  cells..........................................................................20 CM
1.4  Effector T cells................................................................................................................21 
1.5  Generation and maintenance of memory T cells...........................................................22 
1.5.1  IL‐2, IL‐15, IL‐7 cytokines and their receptors........................................................22 
1.5.2  Naive T cell maintenance.......................................................................................25 
1.5.3  T cell activation and clonal expansion....................................................................25 
1.5.4  Memory T cell generation and the role of IL7Rα...................................................25 
1.5.5  Maintenance of memory T cells.............................................................................27 
1.6  Understanding the generation of memory T cells.........................................................27 
1.6.1  Definition of signal strength and fitness................................................................27 
1.6.2  Lineage relationship of memory T cells..................................................................29 
2  AIM OF THE WORK..........................................................................................................33 
3  MATERIALS AND METHODS............................................................................................37 
3.1  Materials........................................................................................................................39 
3.2  Cell culture handling.......................................................................................................43 
3.3  Isolation of PBMC...........................................................................................................43 
3.4  Magnetic cell separation (MACS®).................................................................................43 
3.4.1  Isolation of monocytes...........................................................................................44 
3.4.2  Isolation of CD4 T cells44 
3.5  Immunofluorescence, Flow Cytometry and FACS..........................................................45 
3.5.1  Analysis of surface molecules................................................................................47 
3.5.2  Intracellular staining...............................................................................................47 
3.5.3  Naive T cell sorting.................................................................................................48 
3.5.4  Antigen‐experienced T cell sorting.........................................................................49 
3.6  Labeling of T cells with CFDA‐SE.....................................................................................49 
3.7  Cell culture conditions....................................................................................................50 
3.7.1  In vitro priming of naive CD4 T cells.......................................................................50 
3.7.2  Stimulation conditions for analysis of proliferation...............................................50 
7  
 Index 
 
3.7.3  Stimulation conditions for analysis of cytokine production...................................51 
3.7.4   for analysis of cell signaling...............................................52 
3.8  Enzyme‐linked immunosorbent assay (ELISA)................................................................52 
3.9  Detection of phosphoproteins by immunoblotting.......................................................53 
3.10  Microarray......................................................................................................................54 
3.11  Statistical analysis...........................................................................................................55 
4  RESULTS..........................................................................................................................57 
4.1  Analysis of in vitro generated TSST‐specific CD4 T cells according to IL7R and  
CCR7 expression.............................................................................................................59 
+4.1.1  Modulation of IL‐7R (IL7R)expression in human CD4  T cells primed by  
different levels of stimulation................................................................................59 
+4.1.2  Functional properties of human primed CD4  T cells defined by IL7R and CCR7..62 
hi +4.1.3  Properties of the IL7R CCR7  subset generated at different strengths  
of stimulation.........................................................................................................64 
hi +4.1.4  Cytokine receptor signaling capacity of IL7R CCR7  T cells obtained at  
different levels of stimulation67 
hi +4.1.5  Gene expression profile of high stimulated IL7R CCR7  T cells.............................69 
4.2  Analysis of ex vivo antigen‐experienced CD4 T cells according to the expression  
of IL7R and CCR7................................................................................................................72 
4.2.1  F