Analyzing the regulation of the subcellular localization of {β-catenin [beta-catenin] by fluorescence recovery after photobleaching [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Eva Isabelle Krieghoff

Eva Lecomte

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• Publié par: friedrich-alexander-universitat_erlangen-nurnberg
• Publié le: 01 janvier 2006
• Nombre de lectures: 30
• Langue: Deutsch
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Extrait

Analyzing the Regulation of the Subcellular
Localization of β-catenin by Fluorescence
Recovery After Photobleaching










Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades













vorgelegt von
Eva Isabelle Krieghoff
aus Bonn







Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg



































Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. D.-P. Häder

Erstberichterstatter: Prof. Dr. J. Behrens

Zweitberichterstatter: Prof. Dr. T. Winkler

Tag der Doktorprüfung: 6. April 2006
II
Danksagung

So viele Menschen haben mich während meiner Doktorarbeit begleitet und
unterstützt, dass ich unmöglich alle im Einzelnen erwähnen kann. Ich danke allen
Mitarbeitern der Experimentellen Medizin II für Hilfe in Computer- und Pipettierfragen,
wissenschaftliche und nichtwissenschaftliche Diskussionen, Mitbringen von
Schokolade, Obst und Gemüse, Zellaussaat, Literatursuche und eine gute
Arbeitsatmosphäre.

Besonders bedanke ich mich
• bei Prof. Dr. Jürgen Behrens für die Möglichkeit, unter sehr guten
Arbeitsbedingungen eine Dissertation in einem spannenden Bereich der Zell-
und Molekularbiologie anzufertigen;
• bei Prof. Dr. Thomas Winkler für die Übernahme des Zweitgutachtens;
• bei PD Dr. Robert Slany als Zweitprüfer;
• bei Dr. Bernhard Mayr für methodische, statistische, formulierungs- und
computertechnische Beratung und zahllose Diskussionen über meine gesamte
Arbeit und die Interpretation von FRAP-Daten und damit de facto für die
Ermöglichung des FRAP-Projekts;
• bei Sigrid Weiler für die gute Zusammenarbeit auf den TIP-1-Projekt;
• bei Angela Döbler für die Lösung bürokratischer Probleme und für
Milchschaum am frühen Morgen;
• bei Felix und Christel für die Begleitung durch sämtliche Höhen und Tiefen der
letzten Jahre
• bei meiner Familie für die Unterstützung in jeder Hinsicht;
• und bei Torsten für alles.
IIIIndex

1 SUMMARY.......................................................................................................... 1
2 ZUSAMMENFASSUNG ...................................................................................... 2
3 INTRODUCTION................................................................................................. 3
3.1 The dual role of β-catenin..................................................................................................................3
3.2 β-catenin domains...............................................................................................................................5
3.3 β-catenin nuclear entry and exit......................................................................................................6
3.4 β-catenin regulators............................................................................................................................8
3.5 Live cell microscopy and FRAP analysis......................................................................................9
3.6 Elucidation of enrichment mechanisms by FRAP.....................................................................10
3.7 Detection of anchorage....................................................................................................................11
3.8 Aim of this work.................................................................................................................................12
4 MATERIALS AND METHODS.......................................................................... 13
4.1 Buffers and Media..............................................................................................................................13
4.1.1 Cloning procedures...................................................................................................................... 13
Western Blot and Co-IP 14
4.1.2 Yeast Two Hybrid .......................................................................................................................... 15
4.1.3 Cell Culture, Immunofluorescence and FRAP....................................................................... 17
4.1.4 Reporter assays ............................................................................................................................ 17
4.2 Kits.........................................................................................................................................................18
4.3 Enzymes................18
4.4 Technical Equipment........................................................................................................................18
4.5 Organisms............19
4.6 Cell Culture and Transfection.........................................................................................................19
4.7 Constructs............20
4.7.1 β-catenin and derivatives ............................................................................................................... 20
4.7.2 Interactors.......... 21
4.7.3 Activators.......................................................................................................................................... 22
4.7.4 Control proteins 22
4.7.5 Mammalian Two Hybrid.................................................................................................................. 22
4.7.6 Yeast Two Hybrid ............................................................................................................................ 23
4.7.7 Oligonucleotides for cloning 23
4.7.7.1 FRAP project oligonucleotides .................................................................................................. 23
4.7.7.2 Yeast Two Hybrid oligonucleotides........................................................................................... 25
4.8 Reporter assays.................................................................................................................................25
4.9 Co-Immunoprecipitation and Western Blot.................................................................................26
4.10 Immunofluorescence........................................................................................................................26
4.11 Yeast Two Hybrid screening...........................................................................................................27
4.12 Live cell imaging and FRAP assays..............................................................................................27
5 RESULTS.......................................................................................................... 29
5.1 YFP- β-catenin is functional in cell adhesion and Wnt signalling..........................................29
5.2 Establishing the experimental system.........................................................................................31
5.2.1 β-catenin localization................................................................................................................... 31
5.2.2 Nucleo-cytoplasmic shuttling.................................................................................................... 31
5.2.3 β-catenin mobility within one compartment .......................................................................... 34
5.3 Fine-mapping of transport activities within the β-catenin molecule....................................36
5.4 Impact of additional transport on β-catenin shuttling..............................................................42
5.5 Influence of APC................................................................................................................................46
5.6 APC truncation....49
5.7 Influence of axin and axin2/conductin.........................................................................................50
5.8 CRM-1 dependence of β-catenin cytoplasmic enrichment.....................................................53
5.9 Influence of E-cadherin....................................................................................................................55
5.10 Export in the absence of „facilitated diffusion“.........................................................................57
5.11 Influence of TCF4 on YFP- β-catenin.............................................................................................58
5.12 f BCL9 and Pygopus2..................................................................................................59
5.13 Influence of β-catenin on BCL9/Pygopus....................................................................................61
5.14 Independence of the observed effects of CFP-tags of the β-catenin interactors.............63
5.15 Influence of 14-3- ζ on