Biotechnological applications of thermophoresis [Elektronische Ressource] / Christoph Jens Wienken. Betreuer: Dieter Braun

Christoph Jens Wienken

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• Physik
• Biologie

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• Publié par: ludwig-maximilians-universitat_munchen
• Publié le: 01 janvier 2011
• Nombre de lectures: 10
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 8 Mo

Extrait

Biotechnological applications of
thermophoresis




Dissertation


zur Erlangung des Grades
Doktor der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

der Fakultät für Physik
der Ludwig-Maximilians-Universität München

vorgelegt von
Christoph Jens Wienken
aus Kissing


München, Mai 2011




















Erstgutachter: Prof. Dr. Dieter Braun
Zweitgutachter: Prof. Dr. Hermann E. Gaub
Mündliche Prüfung am 04. Juli 2011
Table of Contents
I. Summary....................................................................................................................... 1
II. Introduction - Thermophoresis of biomolecules .......................................................... 3
III. Theory and Experimental Details ................................................................................. 4
a. Basics of thermophoresis .............................................................................................. 4
b. Schematic Experimental Setup ..................................................................................... 7
c. Thermophoresis Measurements .................................................................................... 8
d. Conclusions ................................................................................................................ 11
IV. Thermophoresis of single-stranded DNA ................................................................... 12
a. Measurements of ssDNA ............................................................................................ 12
b. Conclusions 14
V. Binding studies with Thermophoresis ........................................................................ 15
a. Thermophoresis - a tool to study biomolecular interactions ...................................... 15
b. Protein binding reactions measured with thermophoresis .......................................... 16
c. Buffer dependence of aptamer binding reactions analyzed with thermophoresis ...... 19
d. Effects of competitive interactions in serum .............................................................. 21
e. Interactions of membrane proteins using intrinsic protein fluorescence .................... 23
f. Conclusions ................................................................................................................ 25
VI. Melting studies with Thermophoresis ........................................................................ 28
a. Thermophoretic DNA melting curves 28
b. Conclusions 34
VII. Outlook ....................................................................................................................... 36
VIII. References .................................................................................................................. 38
IX. Acknowledgements .................................................................................................... 44
X. Curriculum Vitae ........................................................................................................ 45
XI. Appendix A: Detailed description of the experimental setup .................................... 46
XII. Appendix B: Measurement control using LabView ................................................... 50
XIII. Appendix C: Publications ........................................................................................... 62

I. Summary
For over 150 years it is known that particles in a temperature gradient conduct a directed
movement. This is called the Soret effect or thermophoresis. Still the underlying physical
principles of thermophoresis in aqueous solutions are not totally understood. In the first
part of this thesis new experiments on the thermophoresis of small single-stranded DNA
oligonucleotides try to elucidate the fundamental principles of the Soret effect and the
results seem to support a thermodynamic description of the thermophoretic movement.
With this approach the experimental results for DNA could be predicted without free
fitting parameters. Assuming this theory the thermophoretic movement mainly depends on
the strength of ionic shielding and on the hydration sphere of the particle. This direct
influence of the water-particle interface implicates that thermophoresis is very sensitive to
even slight changes of particles. Applied to biomolecules like DNA or proteins the Soret
effect allows for a precise analysis of the molecule under investigation. Any binding
reaction, for example, will at least result in a change of the hydration sphere of the
molecule and thus, binding reactions are readily accessible with thermophoresis.
This is demonstrated in the second part of this work. The experiments range from DNA
aptamers binding to nucleotides or proteins over protein-protein interactions to single ion
binding. Especially low molecular weight binders like small molecules or ions are
notoriously difficult to measure with standard interaction analysis tools. Interestingly, in
thermophoresis measurements the signal to noise ratio does not significantly depend on
the molar weight ratio as it is the case for other interaction analysis techniques. High
affinities in the nanomolar regime are equally well measured as low affinities in the high
micromolar range. The thermophoretic method also allows monitoring interactions of
biomolecules directly in biological liquids like cell lysate or blood serum. To overcome
potential influences of the typically used fluorescent label on the interaction strength,
intrinsic protein fluorescence is also suitable for monitoring the thermophoretic movement
of proteins. This approach allows a complete label-free measurement of protein
interactions directly in solution without any labeling or surface functionalizing procedure.
Third, also structural changes of molecules could be analyzed with thermophoresis. This is
demonstrated in the last part of this thesis with measurements on the thermal stability of
nucleic acids. Most conformational changes affect at least the hydration sphere of a
molecule and thus lead to a measurable readout in the thermophoresis signal. Again, the
thermophoretic method shows a high sensitivity for small changes in the molecule
structure and thus, allows for revealing intermediate states upon the unfolding of nucleic
acids.
1 Zusammenfassung
Bereits vor mehr als 150 Jahren entdeckten Charles Soret und Carl Ludwig die Bewegung
von Teilchen in einem Temperaturgradienten. Aber bis heute sind die zugrundeliegenden
Mechanismen für diese Thermophorese (auch Soret Effekt) in wässrigen Lösungen nicht
vollständig verstanden. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden neue Experimente mit kurzen
einzelsträngigen DNA Oligonukleotiden durchgeführt, um die fundamentalen Prinzipien
der Thermophorese aufzuklären. Die gewonnenen Ergebnisse unterstützen eine
thermodynamische Beschreibung des Soret Effekts und es war möglich mit dieser Theorie
die Messergebnisse ohne freie Fitparameter vorherzusagen.
Von dieser Theorie ausgehend bestimmen hauptsächlich die ionische Abschirmung eines
Teilchens in Lösung und die Hydrathülle die thermophoretische Bewegung. Der direkte
Einfluss der Hydrathülle impliziert, dass die Thermophorese äußerst sensitiv auf kleinste
Änderungen in den Eigenschaften der gemessenen Teilchen sein sollte. Der Soret Effekt
sollte also eine sehr genaue Charakterisierung von Biomolekülen wie beispielsweise DNA
Molekülen oder Proteinen erlauben. Damit sind auch Analysen von Bindungsreaktionen
möglich, da jedes bindende Molekül mindestens die Hydrathülle ändern sollte.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde die breite Anwendbarkeit der Thermophorese zur
Analyse von biomolekularen Interaktionen dargestellt. Dafür wurden Interaktionen aus
vielen verschiedenen Biomolekülklassen analysiert, angefangen bei DNA Aptameren die
Proteine oder einzelne Nukleotide binden, über Protein-Protein Interaktionen bis hin zu so
2+kleinen Bindungspartnern wie einzelnen Ca -Ionen. Hoch affine Interaktionen im
nanomolaren Bereich konnten mit einer ähnlichen Genauigkeit gemessen werden wie
schwach affine Bindungen im hohen mikromolaren Bereich. Außerdem erlaubt die
thermophoretische Messmethode, Interaktionen direkt in biologischen Flüssigkeiten, wie
zum Beispiel Zelllysat oder Blutserum, zu messen. Um einen möglichen Einfluss des
Fluoreszenzlabels auf die Interaktion zu verhindern, kann bei vielen Proteinen die
intrinsische Proteinfluoreszenz genützt werden. Dies erlaubt die Molekülbewegung von
nativen Proteinen zu messen und schafft die Grundlage für eine Label-freie Analyse von
Interaktionen direkt in Lösung.
Desweiteren kann Thermophorese dafür verwendet werden, um Konformations-
änderungen von Molekülen zu beobachten, da diese meist mit einer Änderung der
effektiven Ladung (und damit der ionischen Abschirmung) oder der Hydrathülle
einhergehen. Dies wurde im dritten Teil dieser Arbeit verwendet um die thermische
Stabilität von Nukleinsäuren zu messen. Dabei konnten