Bovine microRNomics [Elektronische Ressource] : Implications during oocyte maturation and pathophysiology of endometrium / Dagnachew Worku Hailemariam

Dagnachew Worku Hailemariam

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• Publié par: rheinische_friedrich-wilhelms-universitat_bonn
• Publié le: 01 janvier 2011
• Nombre de lectures: 19
• Langue: Deutsch
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Extrait

Institut für Tierwissenschaften, Abt. Tierzucht und Tierhaltung
der Rheinischen Friedrich – Wilhelms – Universität Bonn



Bovine microRNomics: Implications during oocyte maturation
and pathophysiology of endometrium


I n a u g u r a l – D i s s e r t a t i o n
zur Erlangung des Grades

Doktor der Agrarwissenschaft
(Dr. agr.)

der
Hohen Landwirtschaftlichen Fakultät
der
Rheinischen Friedrich – Wilhelms – Universität
zu Bonn

vorgelegt im März 2011

von

Dagnachew Worku Hailemariam

aus

West shoa, Äthiopien































Referent: Prof. Dr. Karl Schellander
Korreferent: Prof. Dr. Brigitte Petersen
Tag der mündlichen Prüfung: 04 April, 2011






















Dedicated to my parents
Bovines microRNomics: Bedeutung während der Eizellreifung
und die Pathophysiologie des Endometriums

MikroRNAs (miRNAs), die bereits für die Regulierung von posttranskriptionalen Genen
bekannt sind, konnte eine essentielle Rolle für die Entwicklung von Tieren und Krankheiten
nachgewiesen werden. In dieser Studie wurden bovine miRNAs während der Eizellenreifung
identifiziert und mittels verschiedener Methoden das Expressionsprofil untersucht. miRNAs, die
eine neuartigen molekulare Signatur auf Grundlage einer subklinischen Endometritis zeigten
wurden mit Hilfe eines integrativen Untersuchungsansatzes erforscht. Zuerst wurde die
Identifikation und die Erstellung von Expressionsprofilen von miRNAs während der bovinen
TMEizellenreifung mittels des „miRCURY locked nucleic acids (LNA) array“ (Exiqon,
Vedbeak, Denmark) durchgeführt. Dieser Microarray besteht aus 454 bekannten Sonden von
Mensch, Maus und Ratten miRNAs. Die Ergebnisse zeigten 59 unterschiedlich exprimierte
miRNAs, von denen 31 hauptsächlich in unreifen und 28 in reifen Eizellen überexprimiert
wurden. Hierbei wurden mit verschiedenen Ansätzen 32 neue orthologe bovine miRNAs
identifiziert. Des Weiteren wurden erste Versuche durchgeführt, um die spezifischen
Funktionen von miR-99a und miR-100 innerhalb eines „in-vitro“ Kumuluszellen Modells zu
untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass miR-99a und miR-100 die Expression des bovinen
tribbles homologue 2 Gens (TRB2) runter regulieren. Zum Anderen wurde mittels eines
genomweitem RT² miRNA PCR Arrays, bestehend aus 354 gut beschriebenen humanen
miRNA Primern, an uterinen Cytobrush-Proben von Kühen die entweder an subklinischer
Endometritis erkrankt oder gesund waren, Expressionsanalysen durchgeführt. Das Ergebnis
dieses Versuches zeigte abweichende Expressionen von 23 miRNAs in Geweben von Kühen
mit subklinischer Endometritis im Vergleich zu den gesunden Tieren. Interessanterweise
konvergieren die mittels der Igenuity Pathway Analyse(IPA), identifizierten Gennetzwerke,
bekannten Pathways sowie biologische Funktionen mit den Signalwegen und zellulären
Aktivitäten innerhalb des Endometriums während des Östruszyklus und der Trächtigkeit. Des
Weiteren bestätigte der Luziferase Assay die vorangegangenen Informationen der
bioinformatischen Auswertung und ermöglichte uns einen schlüssigen Zusammenhang
zwischen der veränderten miRNA Expression und den Zielgenen abzuleiten. Zusammengefasst,
zeigt die Identifikation sowie das dynamischen Expressionsmuster der bestimmten Klasse von
miRNAs während der bovinen Eizellreifung ihren potentiellen Einfluss auf die frühe
Embryonalentwicklung; wohingegen die unterschiedliche Expression der uterinen miRNAs bei
Tieren mit subklinischer Endometritis möglicherweise die uterine Genregulation beeinträchtigt.
.
Bovine microRNomics: Implications during oocyte maturation
and pathophysiology of endometrium

MicroRNAs which are known for posttranscriptional gene regulation are evidenced for
their essential role during animal development and disease. In this study, identification
and expression profiling of bovine miRNAs during oocyte maturation are scrutinized
using heterologous approach, while miRNA regulated novel molecular signature
underlying bovine subclinical endometritis was dissected using an integrative approach.
Primarily, identification and expression profiling of microRNAs during bovine oocyte
TMmaturation was investigated using miRCURY locked nucleic acids (LNA) array
(Exiqon, Vedbaek, Denmark) microarray that consist of 454 capture probes for human,
mouse and rat miRNAs. The result revealed differential expression of 59 miRNAs, of
which 31 and 28 miRNAs were found to be preferentially expressed in immature and
matured oocytes, respectively. Here, 32 new bovine orthologous miRNAs were
identified using a heterologous approach. Furthermore, the preliminary attempt to
dissect the specific function of miR-99a and miR-100 in invitro cumulus cell showed
that both miRNAs down regulate bovine tribbles homologue 2 (TRB2). On the other
hand, genome wide RT² miRNA PCR array consisting of 354 well characterized human
miRNA primers was used to analyze miRNA expression in the uterine cytobrush
samples taken from cows with subclinical endometritis and healthy. The result showed
the aberrant expression of 23 miRNAs in cows with subclinical endometritis as
compared to the healthy ones. Interestingly, the Ingenuity Pathway Analysis (IPA) for
high ranking target genes of aberrantly expressed miRNAs identified gene networks,
canonical pathways and biological functions that converged to array of signaling
pathways and cellular activities inherent to the endometrium during estrous cycle and
pregnancy. Furthermore, the luciferase assay data substantiated the primary information
from bioinformatic prediction and enabled us to deduce a convincing link between the
aberrantly expressed miRNAs and target genes. Taken together, identification and
dynamic expression pattern of certain class of miRNAs during bovine oocyte
maturation suggests their potential involvement in early embryo development; where as,
aberrant expression of uterine miRNAs in animals with subclinical endometritis
potentially interfere with the tight uterine gene regulation. VII
Table of contents Pages
Abstract V
List of abbreviations XI
List of tables XIV
List of figures XV

1
1 General introduction

1.1. Bovine oocyte maturation 3
Pathophysiology of the uterus in the context of bovine subclinical
1.2. 5
endometritis

8 2 Literature review

2.1. Bovine folliculogenesis 8
Oocyte somatic cell interaction during folliculogenesis 2.1.1. 11
2.1.2. Oocyte developmental competence 12
2.1.3. Oocyte maturation 15
2.1.3.1. Nuclear maturation 15
2.1.3.2. Cytoplasmic maturation 16
2.1.4. Transcription factors as mammalian oocyte gene expression regulators 18
2.1.4.1. Oct-4: germ cell specific transcription factor 19
2.1.4.2. FIGa: a transcription factor that regulates zona pellucida genes 19
2.1.4.3. NoBox: oocyte-specific genes transcription regulator 20
2.1.4.4. ALF: general transcription factor 20
2.2. Discovery of microRNAs as posttranscriptional gene regulators 21
2.2.1. MicroRNA biogenesis 22
2.2.2. Principles of target recognition by miRNAs and mode of action 24
2.2.3. MicroRNA involvement in early development 28
2.2.4. Implication of miRNAs in mammalian fertility 30
2.2.5. Role of miRNAs in immune system development 32
VIII

2.2.6. MicroRNA and uterine pathophysiology 35
2.2.6.1. Inflammation 36
2.2.6.2. Cell growth, proliferation and apoptosis 37
2.2.6.3. Angiogenesis 38
2.2.7. Potential role of miRNAs in endometrial transcriptome dynamics and
39
endometritis


3. Part I: Identification and expression profiling of miRNAs during oocyte
maturation 41

3.1. Part I: Materials and methods 42
3.1.1. Materials 42
3.1.1.1. List of laboratory equipments used during the study 42
3.1.1.2. List of chemicals, competent cells and kits 43
Growth media and solutions 3.1.1.3. 47
3.1.1.4. List of soft wares and data bases used during the study 50
3.1.2. Methods 51
3.1.2.1. Heterologous approach 51
3.1.2.2. Oocyte collection, in vitro maturation, sperm capacitation and IVF 51
3.1.2.3. In vitro culture and embryo collection 52
3.1.2.4. Brilliant cresyl blue (BCB) staining of COCs 52
3.1.2.5. Total RNA isolation, miRNA amplification and invitro transcription 53
3.1.2.6. miRNA labeling and hybridization 55
3.1.2.7. MicroRNA array scanning and data analysis 56
3.1.2.8. MicroRNA qRT-PCR for microarray validation 56
3.1.2.9. Retrieving miRNA targets and chromosomal location 57
3.1.2.10. Total RNA isolation and cDNA synthesis for analysis of target genes 57
3.1.2.11. Real-time quantitative PCR for target genes 58
3.2.