Caractérisation du rôle d'Unr, une protéine de liaison à l'ARN, dans les cellules souches embryonnaires murines

Habiba Elatmani

Description

Sous la direction de Hélène Jacquemin-Sablon
Thèse soutenue le 17 décembre 2009: Bordeaux 2
Le gène unr (upstream of N-ras) code une protéine de liaison à l’ARN, Unr, qui régule la stabilité et la traduction d’ARN messagers cibles. L’invalidation du gène unr chez la souris conduit à une létalité embryonnaire à mi-gestation (10,5 jours post-coitum, jpc). Unr est donc essentielle pour le développement de la souris. Le phénotype le plus frappant des embryons unr-/- est leur petite taille qui est déjà visible à 8,5jpc. Ce phénotype pourrait refléter un problème précoce de prolifération/différenciation au cours du développement qu’il est possible d’étudier dans les cellules souches embryonnaires (ES). Les cellules ES sont dérivées des cellules pluripotentes des embryons au stade blastocyste (3,5jpc). Les cellules ES peuvent s’auto-renouveler c’est à dire proliférer indéfiniment sous forme non différenciée ce qui correspond à leur état pluripotent ou différencier en tous les types cellulaires (lignages) adultes dérivés des feuillets primordiaux (endoderme définitif, mésoderme et ectoderme) ce que défini la pluripotence. Ces deux propriétés des cellules ES conditionnent leur devenir et définissent leur identité. Nous avons remarqué que les cellules ES unr-/- ont tendance à différencier spontanément alors qu’elles sont cultivées dans des conditions qui les maintiennent dans un état non différencié et prolifératif (état pluripotent). En routine, les cultures de cellules ES unr-/- contiennent environ 25% de cellules morphologiquement différenciées. Nos travaux montrent en effet, qu’elles différencient en endoderme primitif. Nous avons reproduit ce phénotype dans une autre lignée des cellules ES de fond génétique différent par déplétion stable d’Unr. La restauration de l’expression d’Unr dans les cellules ES unr-/- limite fortement leur engagement en différenciation. Unr contribue donc au maintient de l’état pluripotent des cellules ES en prévenant leur différenciation spontanée vers le lignage endodermique primitif (Epr). Ce tissu au cours du développement va former l’épithélium de la poche embryonnaire ou sac vitellin. Nos données préliminaires montrent que les cellules ES en absence d’Unr maintiennent tout de même leur capacité de différenciation multi-lignages (endoderme définitif, mésoderme et ectoderme) quand celle-ci est induite. Ensuite, nous nous sommes intéressés au(x) mécanisme(s) d’action d’Unr. Nous avons fait l’hypothèse qu’Unr pourrait directement agir en régulant positivement des gènes qui inhibent la différenciation des cellules ES en Epr ou en régulant négativement des gènes qui l’induisent. Nous avons identifié le gène gata6 comme cible potentielle d’Unr. Une augmentation modérée de l’expression du facteur de transcription Gata6 dans les cellules ES conduit à une autorégulation positive du gène gata6 et induit la différenciation des cellules ES en Epr. Nos données suggèrent qu’Unr pourrait directement déstabiliser les ARNms Gata6 dans les cellules ES afin de prévenir leur différenciation spontanée en Endoderme primitif.
-Unr
-Etat pluripotent
-Stabilité
-Cellules souches embryonnaires (ES)
-Pluripotence
-Différenciation spontanée
-Gata6
-Endoderme primitif
-ARN messagers
Unr (upstream of N-ras) is a cytoplasmic RNA-binding protein with cold shock domains, involved in regulation of messenger RNA stability and translation. Unr is essential to mouse development since Embryos deficient for Unr die at mid-gestation. Here we report that unr knockout ES cells maintained under growth conditions that sustain self-renewal spontaneously differentiate toward the primitive endoderm (PrE) lineage. This phenotype was reproduced in another ES line (E14tg2a) after shRNA-induced Unr depletion. Moreover, Unr rescue in Unr-deficient ES cells limits their PrE differentiation engagement. However, Unr is dispensable for multilineage differentiation, as shown by knockout ES cells capacity to produce differentiated teratomas. We further investigated the molecular mechanisms underlying the differentiation of unr-/- ES to primitive endoderm, and found that Unr acts downstream of Nanog. Our data also show Gata6 mRNAs are more stable in Unr-deficient ES cells as compared to wild-type ES cells. We propose that the possible repression by Unr of this key inducer of PrE differentiation at a post-transcriptional level may contributes to the stabilization of ES cells pluripotent state.
Source: http://www.theses.fr/2009BOR21681/document

Sujets

• Union pour la nouvelle République (France)
• Stabilité
• Pluripotence

Informations

• Publié par: Thesee
• Nombre de lectures: 52
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 9 Mo

Extrait

  Année 2009  

Université Victor Segalen Bordeaux 2  

_ Thèse n° 4830  

THÈSE   pour le   AUX 2

DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ BORDE   Mention : Biologie-santé   Option : Biologie cellulaire et physiopathologie     Présentée et soutenue publiquement   Le 17 Décembre 2009   ParHabiba ELATMANI     Née le 18 Septembre 1981 à Vernon (27)  

  Caractérisation du rôle d’Unr, une protéine de liaison à l’ARN, dans les cellules souches embryonnaires murines         Membres du Jury     M CULLIN Christophe. ...................................... .................................Président  Professeur de l’Université Bordeaux II Mme MORELLO Dominique ......................................... .....................Rapporteur Directeur de recherche CNRS, Université Toulouse III M AVNER Philippe................................................................ ............. ..Rapporteur  Directeur de recherche CNRS, Institut Pasteur M LE MENUET Damien........................................ ...... ........................Examinateur Chargé de recherche INSERM, Université Paris XI Mme JACQUEMIN-SABLON Hélène................................ ................ Directeur de thèse Chargé de recherche INSERM, Université Bordeaux II  

 

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     APAF-1: Apopstic Protease-Activating Factor 1 ARE: AU-rich elements ARE-BPs: ARE Binding Proteins ARN: Acide RiboNucléique ARNm (s): ARN messager (s) ARNt: ARN de transfert CSD: Cold Shock Domain CSPs: Cold Shock Proteins DCC: Dosage Compensation Complex Dcp1/2/S: Decapping protein 1/2/S E: jour Embryonnaire eEF1A: eukaryotic Elongation Factor A eIF2: eukaryotic Inition Factor 2 eIFs :eukaryotic Initiation Factors Epi: Epiblaste Epr: Endoderm primitif ES: Embryonic Stem   IRES: Internal Ribosome Entry Site ITAFs: IRES Trans Acting Factors JAK: Janus Kinase Kb: Kilobase KDa: KiloDalton LIF: Leukemia Inhibitory Factor MCI: Masse Cellulaire Interne miARN: microARN mCRD: major Coding Region of Determinant of instability miRNP (s): miARN RiboNucleoProteic complex (s) Msl-2: Male specific lethal-2 PABP: PolyA Binding Protein

PAIBP1: PABP Interacting Protein 1 PABPII: PolyA Binding Protein II

 

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PAP: PolyA Polymérase PARN: PolyA-specific RiboNuclease pb: paire de base pré-ARNm (s): ARN pré-messager (s) Pré-miARN (s): précurseur miARN (s) Pri-miARN (s): miARN (s) primaire (s) PTB: Polypyrimidine Tract Binding protein PTH: Parathyroid Hormon RBP: RNA Binding Protein RISC: RNA Induced Silencing Complex RRM: RNA Recognition Motif SMG: Smaug Sxl: Sex lethal TE: Trophectoderme unr: Upstream of N-ras(gène) 3’NT: Region 3’ Non Traduite

5’NT: Region 5’ Non Traduite       

 

3

 

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Introduction………………………………………………………………………………….6

 

 

I) Unr, une protéine de liaison à l’ARN impliquée dans la régulation post-transcriptionnelle de l’expression des gènes. ...................................................................................................... 7   1) Le gèneunrcode une protéine de liaison à l’ARN conservée au cours de l’évolution. 7   A) Découverte du gène unr: upstream of N-ras. ............................................................ 7   a) Historique. .............................................................................................................. 7   b) Le gène unr code une protéine à cinq domaines « cold- shock ». ......................... 8   B) Les protéines à domaine cold shock chez les procaryotes et les eucaryotes. ............ 8   a) Structure du domaine cold shock. .......................................................................... 8   b) Les protéines à domaine cold- shock chez les procaryotes.................................... 8   c) Les protéines à domaine cold-shock chez les eucaryotes. ..................................... 8  

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C) Unr, une protéine de liaison à l’ARN ubiquitaire et conservée au cours de l évolution. ................................................................................................................... 10   ’ a) Rôle Fonctionnel et localisation subcellulaire de la protéine Unr. ...................... 10   b) Conservation d’unr au cours de l’évolution......................................................... 10   c) L’expression d’unr est ubiquitaire. ...................................................................... 10   )   Unr participe à la régulation post-transcriptionnelle de l’expression des gènes. ..... 11   A)   Introduction aux régulations post-transcriptionnelles de l’expression des gènes chez les eucaryotes. ...................................................................................................... 11   a) Vue générale des différents niveaux de régulation de l’expression des gènes. ... 11   b) Les régulations post transcriptionnelles de l’expression des gènes ..................... 12   B)    .......................................... 13des ARNms : traduction et dégradation.Le devenir   a) Modifications post-transcriptionnelles du pré- ARNm : ajout de la coiffe 5’ et de la queue polyA. ........................................................................................................ 13   b) La traduction des ARNms.................................................................................... 13   b1) L’initiation de la traduction coiffe dépendante. ................................................. 14   b2) La traduction dépendante d’IRES. ..................................................................... 15   c) Dégradation des ARNms...................................................................................... 15   c1) Enlèvement de la queue polyA. ......................................................................... 15   c2) Enlèvement de la coiffe 5’. ................................................................................ 16   C) Modes de régulation de la traduction et de la stabilité des ARNms. ...................... 17   a) Régulations post-transcriptionnelles par les microARNs. ................................... 17   b) Régulation post-transcriptionnelle par les éléments AU-rich .............................. 20   D) UNR régule la stabilité et la traduction d’ARNms. ................................................ 21   a) Régulation de la stabilité des ARNms. ................................................................ 21   b) Régulation traduction dépendante d’IRES........................................................... 23  

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c) Régulation de la traduction coiffe dépendante..................................................... 23   E) Régulations post-transcriptionnelles et développement : Unr essentielle pour le développement de la souris .......................................................................................... 25   a) Détermination des axes de l’embryon de drosophile par une succession d’inhibition de traduction. ........................................................................................ 25   b) La protéine Unr est essentielle pour le développement embryonnaire de la drosophile et de la souris. ......................................................................................... 26   b1) Unr et dosage génique compensatoire du chromosome X chez la drosophile... 26   b2) Le gène unr est essentiel pour le développement de la souris. .......................... 27   II) Développement embryonnaire précoce de la souris et cellules souches embryonnaires murines. ................................................................................................................................ 30   1) Le développement embryonnaire précoce chez la souris. ........................................... 30   A) De la fécondation à la formation du blastocyste ..................................................... 30   a) Clivage de l’embryon, compaction et formation du blastocyste. ......................... 30   b) Spécification des premiers lignages cellulaires. .................................................. 32   b1) Ségrégation du trophectoderme et de la masse cellulaire interne ...................... 33   b2) Ségrégation de l’endoderme primitif et de l’épiblaste. ...................................... 34   B) De l’implantation à la gastrulation. ......................................................................... 36   a) Implantation et formation de l’œuf cylindre ........................................................ 36   b) La gastrulation: différenciation de l’épiblaste, formation des feuillets primordiaux .............................................................................................................. 37   2)    39Les cellules souches embryonnaires murines...........................................................   A) Description des cellules souches embryonnaires. ................................................... 39   a) Propriétés des cellules souches embryonnaires.................................................... 39   b) Culture des cellules ES murines. ......................................................................... 41   B) Etablissement, maintien et régulation de la pluripotence........................................ 41   a) Identification de gènes clés de pluripotence: oct4, sox2 et nanog. ...................... 41   a1) Oct4 .................................................................................................................... 41   a2) Sox2.................................................................................................................... 42   a3) Nanog. ................................................................................................................ 42   b) Circuit transcriptionnel de régulation de la pluripotence..................................... 45   c) MicroARN et cellules ES..................................................................................... 46  

Objectifs……………………………………………………………………………………...48    Résultats……………………………………………………………………………………...49    Discussion…………………………………………………………………………………….76    Perspectives…………………………………………………………………………………..80 

Bibliographie………………………………………………………………………………...82 

 

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I) Unr, une proté ne de liaison à l’ARN impli régulation post- ranscriptionnelle de l’expressio

1) Le gèneunrcode  de l’évolution.

  A) Découverte du gène 

uée dans la   des gènes.

ne protéine de liaison à l’ARN conservée au cours 

nr: upstream ofN-ras.

a) Historique.                                                                                                                       

C’est au cours d études intensives visant à caractériser le pr moteur du gène N- rasque le gèneunra été découvert. Deux équipes qui travaillaien l’une chez le rat et l’autre chez l’ho me, ont simultanément mis en évidence une unité transcriptionnelle active localisée immédiatement en amont du g ne N-ras, qui a été nomméeunr pourstream of N-ras(1, 2). Les locusunr et -ras un constituent tandem de gènes  danstra scrits la même oenriitatno chez l’hom e et les rongeurs, la  distance teinuqinégr étant paeremtntrciluèi courte (150 pb chez l’homme et 130 pb  chez la souris). Le ène unr est transcrit en trois ARN mess gers (ARNms) qui  diffèrent par leur extrémité 3’(1, 2). En effet, trois sé uences signal de  polyadénylation, A1, A2 et A3, sont situées dans la région 3’no traduite (3’NT) à  1Kb, 450pb et 150p cepsertnemevit du principal site d’initiatio de la trapiitsnrcno  du gène N-ras( 1Figu e). Ces éléments impliquent que le prom teur du gène N-ras est en partie conten dans le gène unr. L’expression ubiquitai e de ce tandem de  gènes, ainsi que la endance des transcrits N-ras à être moins abondants que les transcrits Unr, a conduit à l’hypothèse d’une interférence transc iptionnelle au sein  de ce locus. En d’au res termes, la transcription d’unr limiterait ’accès de la région romotrice du gène -rasà la meirenihca de transcription. Cepe dant, il s’est avéré  que cette interférenc était faible et ne constituait pas un méca isme majeur de la  régulation transcripti nnelle de l’expression de N-ras(3).

                                  Figure 1: Organisation du locus unr/N-ras(3).        

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b) Le gène unr code une protéine à cinq domaines « cold- shock ».

Le gèneunr code chez l’homme une protéine présente sous deux isoformes, une mineure et une majeure de 798 et 767 acides aminés respectivement, issues de l’épissage alternatif de l’exon 5(4). Les formes majeure et mineure ont une masse moléculaire respective d’environ 85 et 88 KDa. Lors de la découverte du gèneunr, l’alignement de sa séquence protéique contre les bases de données n’a mis en évidence aucune homologie avec des protéines connues(1, 2). Seule la recherche de motifs conservés et la modélisation de la structure secondaire de la protéine Unr ont montré qu’elle appartient à la famille des protéines à domaine « choc froid » ou cold-shock(5, 6). Ce domaine, très conservé au cours de l’évolution est décrit chez les procaryotes et les eucaryotes, il constitue un domaine de liaison aux acides nucléiques simples brins.

B) Les protéines à domaine cold shock chez les procaryotes et les eucaryotes.

a) Structure du domaine cold shock.

Le domaine cold shock (CSD) est un domaine de liaison aux acides nucléiques, d’environ 70 acides aminés, très conservé au cours de l’évolution. La structure secondaire du CSD correspondant à cinq feuilletsβantiparallèles qui se replient dans l’espace en un tonneauβ(7, 8). Cette structure tridimensionnelle est semblable à celle des domaines de liaison à l’ARN RRM (RNA Recognition Motif) présents dans de nombreuses protéines de liaison à l’ARN (RBPs, RNA Binding Proteins). De plus, le CSD renferme deux motifs conservés de liaison aux acides nucléiques simples brins, RNP1 et RNP2 (huit et six acides aminés respectivement) caractéristiques des domaines RRM(9-11).

b) Les protéines à domaine cold- shock chez les procaryotes.

Chez les bactéries (dont certainesarchaebactéries), la majorité des protéines à domaines cold shock sont induites suite à un choc froid. Elles constituent la famille des protéines de choc froid ou CSPs (Cold Shock Proteins) qui possèdent toutes un unique domaine CSD. Chez les bactéries, les protéines contenant un CSD constituent 10 % des protéines synthétisées après un choc froid. Elles permettent aux bactéries de s’adapter à la baisse de température et de reprendre ainsi leur croissance. En effet, le choc froid stabilise les structures secondaires de l’ARN et de l’ADN ce qui rend difficile le travail des ARN et ADN polymérases. Les CSPs vont agir comme des chaperonnes de l’ADN et de l’ARN, elles vont déstabiliser ces structures secondaires et permettent ainsi la reprise de la réplication, de la transcription et de la traduction(12). 

c) Les protéines à domaine cold-shock chez les eucaryotes.

Chez les eucaryotes, à la différence des procaryotes, les protéines à CSD ne sont pas induites à la suite d’un choc froid. Elles participent à des processus biologiques divers tels que la prolifération, la résistance aux drogues et le développement. Chez 8

   

   

les eucaryotes, les p otéines à CSD sont des protéines de liais n à l’ARN et pour certaines constituent également des facteurs de transcription. P usieurs familles de  rotéines à CSD so t décrites chez les eucaryotes tels que la amille de protéine        Y-box, les protéines IN28 (LIN28a et LIN28b), les protéines ric es en glycine chez  les plantes et Unr. Leur domaine CSD est associé à des d maines protéiques  additionnels, tels qu des ilots iques/sramotabsaqieu chez la fa ille des protéines Y-box de vertébré (13) ou des doigts de zinc dans la rotéine LIN28 de  C.elegans(14) et dan un groupe de protéines riches en glycines hez les plantes(15). Ces domaines compl mentaires leur confèrent une plus grande spécificité de substrat ou une fonction en ymatique supplémentaire(16, 17). Unr fait figure d’exception  dans cette famille pr téique puisqu’elle possède cinq CSD (Figur 2).

 Figure 2: Organisatio

 

 

 

 

   

                 modulaire des protéines à domaine cold-shock chez les eucaryotes(16).

  Les protéines de la famille Y- ox chez  les vertébrés sont de loin les protéines à  CSD les plus étudi es.  Elles ont été décrites à l’origine com e des facteurs de  transcription se lian à l’ADN sur les boîtes Y présentes au iveau des régions  promotrices de gèn s cibles(18). Depuis, leur implication d ns le stockage, la  régulation de la dem -vie et de la traduction d’ARNms ont fait l’ bjet de nombreuses  études. YB-1 est le embre de cette famille le plus étudié et se t ouve être à ce jour  la protéine de liaison aux acides nucléiques la plus conservée au cours de l’évolution.  Cette dernière partic pe à des fonctions cellulaires variées telles que la prolifération  cellulaire, la résis ance aux drogues, la réparation de l’ADN ou encore  l’épissage(19). 

       

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