Caractérisation fonctionnelle des inhibiteurs de Cyclin-Dependent Kinase (CDK) dans le fruit de tomate (Solanum lycopersicum), Functional characterization of Cyclin-Dependent Kinase (CDK) inhibitors in tomato fruit (Solanum lycopersicum)

Mehdi Nafati

Description

Sous la direction de Christian Chevalier
Thèse soutenue le 18 juin 2010: Bordeaux 2
Au sein de l’unité mixte de recherche 619 de l’Institut National de Recherche Agronomique, le groupe « Organogénèse du Fruit et Endoréduplication » étudie les acteurs moléculaires prenant part au contrôle du cycle cellulaire dans le fruit de tomate. L’objet de la présente thèse est l’étude de l’inhibiteur du cycle cellulaire Kip-Related Protein, et son rôle durant le développement du fruit. Identification de motifs protéiques fonctionnels chez l’Inhibiteur de Kinase Cycline-Dependent SlKRP1 chez Solanum lycopersicum : Leur rôle dans les interactions avec des partenaires du cycle cellulaire Les Kip-related proteins (KRPs) jouent un rôle majeur dans la régulation du cycle cellulaire. Il a été montré qu’ils inhibent les complexes CDK/Cyclin et ainsi bloquent la progression du cycle cellulaire. Malgré leur manque d’homologie avec leurs homologues animaux au delà de leur motif de liaison CDK/Cyclin, localisé à l’extrémité C-terminal de la protéine dans les séquences de plante, des études antérieurs ont montré la présence de motifs conservés spécifiques aux plantes chez certaines KRPs. Nous n’avons cependant que peu d’information concernant leur fonction. Nous montrons ici que les KRPs sont distribués en deux sous groupes phylogénétiques, et que chaque sous-groupe dispose de courts motifs spécifiques conservés. Les KRPs du sous-groupe 1 disposent ainsi de six motifs conservés entre eux. Utilisant SlKRP1, qui appartient au sous-groupe 1, nous avons identifié des motifs responsables de la localisation de la protéine et de ses interactions protéine-protéine. Nous montrons que le motif 2 est responsable de l’interaction avec CSN5, une sous-unité du complexe signalosome, et que le motif 5 a un effet redondant avec le motif 3 pour ce qui est de la localisation sub-cellulaire de la protéine. Nous montrons de plus que SlKRP1 est capable de guider SlCDKA1 et SlCycD3;1 vers le noyau, et ce même en l’absence du motif de liaison CDK/Cycline précédemment référencé. Ce nouveau site d’interaction est probablement localisé dans la partie centrale de la séquence de SlKRP1. Ces résultats apportent de nouveaux indices quant au rôle de la partie encore méconnue de cette protéine. La surexpression de SlKRP1 dans le mésocarpe de tomate détruit la proportionnalité entre endoréduplication et taille cellulaire Le fruit est un organe spécialisé résultant du développement de l’ovaire après pollinisation et fertilisation, et qui offre un environnement adéquat pour la maturation des graines et leur dispersion. De part leur importance en nutrition humaine et leur importance économique, les espèces à fruit charnu ont été le sujet d’étude développementales principalement orientée vers la formation de l’ovaire, la mise à fruit et la maturation du fruit. La phase de croissance du fruit a été beaucoup moins étudiée, bien que la division cellulaire et la croissance cellulaire prenant place durant cette période soient cruciales à la détermination de la taille finale du fruit, ainsi que de sa masse et sa forme. Le développement du mésocarpe du fruit de tomate se déroule par la succession d’une phase de division cellulaire suivie d’une phase d’expansion cellulaire associée à l’endoréduplication, menant à la formation de cellules géantes (jusqu’à 0,5mm) avec des niveaux de ploïdie pouvant atteindre 256C. Bien qu’une relation évidente entre endoréduplication et croissance cellulaire ait été montrée par de nombreux exemples chez les plantes, le rôle exact de l’endoréduplication n’a toujours pas été élucidé, étant donné que la plupart des expériences induisant une modification du niveau d’endoréduplication dans la plante affectaient aussi la division cellulaire. Nous avons étudié la cinétique du dévelopement du mésocarpe de tomate au niveau morphologique et cytologique et avons étudié l’effet de la diminution du niveau d’endoréduplication sur le dévelopement du fruit en sur-exprimant l’inhibiteur du cycle cellulaire Kip-Related Protein 1 (SlKRP1) spécifiquement dans les cellules en croissance du mésocarpe de tomate. Nous montrons une proportionnalité directe entre endoréduplication et taille cellulaire durant le développement normal du fruit, ce qui nous a permis de construire un modèle de développement du mésocarpe définissant l’épaisseur du péricarpe en ne prenant en compte que le nombre de divisions cellulaires et le nombre de tours d’endoréduplication. De façon surprenante, les mésocarpes de tomate affectés dans leur niveau d’endoréduplication par la sur-expression de SlKRP1 ne sont pas affectés au niveau de la taille des cellules ou du fruit, ni dans leur contenu métabolique. Nos résultats démontrent pour la première fois qu’alors que le niveau de ploïdie est étroitement lié avec la taille des cellules et du fruit, l’endoréduplication n’est pas responsable de la croissance cellulaire du mésocarpe de tomate.
-Tomate
-Endoréduplication
-Solanum lycopersicum
-Endocycle
-Kip-Related Protein
-Plante
-Cycle cellulaire
-Fruit
Within the Joint Research Unit 619 of the National Institute of Agronomic Research (INRA), the group Organogenesis of the Fruit and endoreduplication examines the molecular players involved in cell cycle control in tomato fruit. The purpose of this thesis is the study of the cell cycle inhibitor Kip-Related Protein and its role during fruit development. Identification of protein motifs in the functional inhibitor of Cyclin-Dependent Kinase in Solanum lycopersicum SlKRP1: Their role in interactions with partners in the cell cycle The Kip-related proteins (KRPs) play a major role in the regulation of cell cycle. It has been shown to inhibit the CDK / Cyclin and thus block cell cycle progression. Despite their lack of homology with their counterparts in animals beyond their binding motif CDK / Cyclin, located at the C-terminal protein sequences in the plant, previous studies have shown the presence of conserved motifs plant specific in some KRPs, but there is little information about their function. We show here that the KRPs are distributed into two phylogenetic groups, and that each subgroup has specific short conserved motifs. The KRPs from subgroup 1 have six conserved motifs. Using SlKRP1, which belongs to subgroup 1, we have identified the motifs responsible for the localization of the protein and protein-protein interactions. We demonstrate that the pattern 2 is responsible for the interaction with CSN5, a subunit of the signalosome complex, and that the motif 5 is redundant with motif 3 with respect to the sub-cellular localization of the protein. We also show that SlKRP1 is capable of guiding SlCDKA1 and SlCycD3; 1 to the nucleus, even in the absence of CDK / cyclin binding motif previously referenced. This new site of interaction is probably located in the central part of the sequence of SlKRP1. These results provide new clues about the role of the little-known part of this protein. Overexpression of SlKRP1 in tomato mesocarp disrupts the proportionality between endoreduplication and cell size The fruit is a specialized organ which results from the ovary after pollination and fertilization, and provides a suitable environment for seed maturation and dispersal. Because of their importance in human nutrition and economic importance, fleshy fruit species have been the subject of study mainly focused on the developmental formation of the ovary, fruit set and fruit ripening. The stage of fruit growth has been much less studied, although cell division and cell growth taking place during this period are crucial to determining the final size of the fruit, as well as its mass and shape. The development of tomato fruit mesocarp occurs by the estate of a phase of cell division followed by a phase of cell expansion associated with endoreduplication, leading to the formation of giant cells (up to 0.5 mm) with ploidy levels of up to 256C. Although a clear relationship between endoreduplication and cell growth has been shown by many examples in plants, the exact role of endoreduplication has still not been elucidated, since most of the experiments leading to a change in the level of endoreduplication in plants also affected cell division. We studied the kinetics of the development of tomato mesocarp morphologically and cytologically and studied the effect of the reduced level of endoreduplication in the development of the fruit over-expressing the cell cycle inhibitor Kip-Related Protein 1 (SlKRP1) specifically in the growing cells of the tomato mesocarp. We show a direct proportionality between endoreduplication and cell size during normal development of the fruit, which allowed us to build a model for development of mesocarp defining the thickness of the pericarp by taking into account the number of cell divisions and the number of rounds of endoreduplication. Surprisingly, the tomato mesocarps affected in their level of endoreduplication by over-expression of SlKRP1 are not affected in terms of cell size and fruit, or on their metabolic content. Our results demonstrate for the first time that while the level of ploidy is closely linked with cell size and fruit, endoreduplication is not responsible for the cell growth of tomato mesocarp.
-Kip-Related Protein (KRP)
-Cyclin-Dependent Kinase (CDK)
-Tomato (Solanum lycopersicum)
-Cell Cycle
Source: http://www.theses.fr/2010BOR21712/document

Sujets

• Tomate
• Cycle cellulaire

Informations

• Publié par: Thesee
• Nombre de lectures: 64
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 17 Mo

Extrait

Université Victor Segalen Bordeaux 2

Année 2010 Thèse N°1712

THESE
Pour le
DOCTORAT DE L’UNIVERSITE BORDEAUX 2
Mention : Sciences, Technologie, Santé
Option : Biologie Végétale

Présentée et soutenue publiquement
Le 18 Juin 2010
Par Mehdi NAFATI
Né le 12 Juillet 1982 à Talence

Caractérisation fonctionnelle des inhibiteurs
de Cyclin-Dependent Kinase (CDK)
dans le fruit de tomate (Solanum lycopersicum)


Membres du Jury :
M. G. Beemster Rapporteur
Mme. M. Causse Examinateur
M. C. Chevalier Directeur de thèse
M. A. Schnittger Rapporteur
M. M. Teichmann Examinateur
Remerciements

Tout d’abord, je tiens à remercier Christian Chevalier, non seulement pour
m’avoir accepté au sein du laboratoire, mais aussi pour nos discussions
enrichissantes et pour sa forte implication durant la préparation et la rédaction des
articles joints dans la présente thèse. Sa capacité à diriger nos recherches tout en
nous laissant une grande liberté de choix, et le caractère profondément humain qu’il
aura su donner au laboratoire resteront parmi mes très bon souvenirs.

Je voudrais aussi remercier Mr Gerrit Beemster, Mme Mathilde Causse, Mr
Arp Schnittger et Mr Martin Teichmann pour avoir accepté d’évaluer mes travaux de
recherche. Disposer d’un jury de thèse comprenant des spécialistes du
développement des plantes, de la physiologie du fruit de tomate, du cycle cellulaire
et de ma protéine favorite fut une chance et un plaisir.

Je ne pourrais pas écrire ces remerciements et omettre Frédéric Gévaudant.
Connu de tous dans les locaux pour sa jovialité, sa bonne humeur, et sa tendance
aux coups de gueule qui démarrent au quart de tour (toujours très divertissants), il
s’est montré d’une patience que je n’ai jamais réussi à briser, malgré mes très
nombreuses tentatives. Son aide, aussi bien scientifique, technique, que matérielle
s’est montrée si déterminante que je me dois d’admettre que les travaux présentés
sont autant siens que miens. Bien qu’il fut un véritable « associé » dans ce travail de
thèse, il m’a néanmoins permis d’explorer toutes les pistes, parfois loufoques, qui
me venaient en tête, sans jamais me décourager et en étant toujours prêt à s’investir.

Une des forces de notre équipe, et dans une certaine mesure, de toute l’UMR,
est l’esprit solidaire de ses membres. Ainsi, je voudrais remercier Michel Hernould,
une mine d’or de connaissance au sein du laboratoire. D’un caractère tranquille,
amical et sincère, d’une capacité de travail digne de Stakhanov, il a été un
professeur d’exception. Mes pensées vont aussi vers Nathalie Frangne, toujours
souriante et prête à discuter de tel ou tel aspect de mes travaux. Je n’oublierai pas
qu’elle s’est lancé d’elle-même pour m’aider plus d’une fois, malgré l’éloignement
relatif de nos sujets d’intérêt au sein du laboratoire. Mes remerciements vont aussi à
Catherine Cheniclet, qui s’est montrée indispensable pour l’étude de mes plantes. Là
encore, Catherine a toujours été prête à m’aider, que ce soit pour me donner de
précieux conseils, m’apprendre différentes techniques, ou pour mettre directement la
main à la pâte. Mes pensées vont aussi vers Frédéric Delmas, à qui je souhaite la
meilleure carrière possible au sein de l’équipe, et Armand Mouras, qui nous
a abandonné pour partir en retraite (quelle idée !!) mais qui trouvait tout de même le
moyen lors de ses brefs passages au laboratoire d’apporter des idées auxquelles
nous n’avions pas pensé. Mes remerciements vont aussi à Patricia Ballias et Aurélie
Honoré. Chacune leur tour elles se sont montrées plus que patientes et arrangeantes
pour ce qui est de mon travail en serre, et elles ont sauvé la vie de mes plantes à
plus d’une reprise !

Mes pensées vont bien sûr aussi vers mes camarades stagiaires, thésards et
post-docs, bien sûr pour les instants de détente mais aussi parfois pour des
discussions scientifiques sérieuses (si si !!). Ainsi, je me souviendrai de points
scientifiques importants, tel que le caractère fondamental et indémodable de la loi de
Beer-Lambert, l’utopie qu’est le RNA-fish, l’implication évidente de la théorie du
chaos dans la PCR ou encore que le calcul du nombre de répétitions nécessaires à
l’obtention d’un Western Blot propre fait appel à la loi des grands nombres. Je saurai
aussi me souvenir que quelle que soit la thématique étudiée, on peut la lier au
potassium.

Bien entendu, je ne vais pas faire des remerciements exhaustifs, tant il y a eu
de gens prêts à m’aider durant ma thèse. Je vous adresse simplement à tous un
grand merci.

La réussite de ma thèse, je la dois aussi à celle qui fait partie de ma vie. Nos
caractères sont opposés sur de nombreux domaines, et tu m’as offert un certain
équilibre qui est pour beaucoup dans l’avancée de mes travaux. Ton soutien a été
indéfectible, et j’espère seulement que j’arrive à te rendre ne serait ce qu’une fraction
de tout ce que tu m’apportes.

Enfin, je pense à mes parents, qui ont toujours été là pour moi. Vous n’avez
hésité devant aucun sacrifice pour m’aider à m’accomplir, et je ne saurai jamais vous
en remercier assez.

TABLE OF CONTENTS

CHAPTER 1 : INTRODUCTION ..........................................................................................6
1 The Cell Cycle................................................................................................................6
1.1 Cell Cycle and Plant Development ..........................................................................6
1.1.1 Overview of Development in Higher Plants.....................................................6
1.1.2 Role of the Cell Cycle in the Establishment and Development of tissues .........7
1.2 The mitotic Cell Cycle ............................................................................................8
1.2.1 The S phase .....................................................................................................9
1.2.2 The M phase....................................................................................................9
1.2.3 Regulation of cell cycle .................................................................................10
2 Molecular mechanisms governing the cell cycle............................................................12
2.1 Classification of Plant Cyclin-Dependent Kinases.................................................13
2.2 Functions of CDK/Cyclin Complexes ...................................................................15
2.2.1 CDKA, central regulator of G1/S and G2/M transitions.................................15
2.2.2 CDKB, and the G2/M transition ....................................................................17
2.2.3 Cyclin-Dependent Kinases involved in basal transcription control: CDKC,
CDKD and CDKE ........................................................................................................18
2.2.4 CDK activating kinase (CAK) and CDK activating kinase activating Kinases
(CAKAK): CDKD and CDKF ......................................................................................19
2.2.5 The E2F Transcription Factors ......................................................................19
2.3 Regulation of CDK/Cyclin activity........................................................................21
2.3.1 Transcriptional regulation of cyclins..............................................................21
2.3.2 Cyclin degradation: role of the Anaphase Promoting Complex (APC) ...........21
2.3.3 CDKs Phosphorylation: WEE1......................................................................22
2.3.4 Steric hindrance and blocking of ATP binding sites: The CDK inhibitors (CKI)
23
3 Role of CDK/Cyc inhibitors in cell cycle control ..........................................................24
3.1 Phylogeny and Structure .......................................................................................24
3.1.1 Two big families: ICK/KRP and SIM............................................................24
3.1.2 Sequence Homology within the KRPs family ................................................25
3.2 Expression and localization of KRPs.....................................................................26
3.2.1 Express