Characterisation of bovine testicular hyaluronidase and a hyaluronate lyase from Streptococcus agalactiae [Elektronische Ressource] : investigations on the effect of pH on hyaluronan degradation and preclinical studies on the adjuvant administration of the enzymes in cancer chemotherapy / vorgelegt von Julia Hoechstetter

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• Publié le: 01 janvier 2005
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Extrait

Characterisation of bovine testicular hyaluronidase and a
hyaluronate lyase from Streptococcus agalactiae
Investigations on the effect of pH on hyaluronan degradation and preclinical
studies on the adjuvant administration of the enzymes in cancer chemotherapy








Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
der Naturwissenschaftlichen Fakultät IV - Chemie und Pharmazie -
der Universität Regensburg





vorgelegt von
Julia Hoechstetter
aus Pappenheim

2005




Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von Februar 2000 bis Januar 2005 unter der
Leitung von Herrn Prof. Dr. A. Buschauer am Institut für Pharmazie der
Naturwissenschaftlichen Fakultät IV - Chemie und Pharmazie - der Universität Regensburg.













Das Promotionsgesuch wurde im Februar 2005 eingereicht.




Prüfungsausschuß: Prof. Dr. W. Wiegrebe (Vorsitzender)
Prof. Dr. A. Buschauer (Erstgutachter)
PD Dr. G. Bernhardt (Zweitgutachter)
Prof. Dr. A. Göpferich (Prüfer)






An dieser Stelle möchte ich mich bedanken bei

Herrn Prof. Dr. A. Buschauer für die Möglichkeit der Anfertigung dieser Doktorarbeit an
seinem Lehrstuhl, die vielfältigen Arbeitsmöglichkeiten am Lehrstuhl sowie für seine
wissenschaftlichen Anregungen und die konstruktive Kritik bei der Durchsicht der Arbeit,
Herrn PD Dr. G. Bernhardt für die wissenschaftliche Anleitung, die Unterstützung bei der
Lösung vieler experimenteller Probleme sowie für seine ständige Diskussionsbereitschaft und
die kritische Durchsicht der Arbeit,
Herrn Dr. T. Spruß für die wissenschaftliche Beratung bei der Planung der Tierversuche,
Herrn Prof. Dr. G. Schmeer (Institut für Physikalische und Theoretische Chemie, Universität
Regensburg) und Herrn Prof. Dr. S. Dove für die Unterstützung bei der Erarbeitung des
theoretischen Modells zur Beschreibung der Enzymkinetik,
Herrn Dr. H.-J. Wittmann für die Berechnung der Ionenstärken,
Frau D. Fischer (Arbeitsgruppe Prof. Dr. A. Geyer, Institut für Organische Chemie,
Universität Regensburg) für die Durchführung der NMR-spektroskopischen Analysen,
Frau I. Asen für die Durchführung der gelelektrophoretischen und zymographischen
Untersuchungen,
Frau E. Hofinger für das zur Verfügung gestellte Hyaluronsäure Hexasaccharid,
Frau S. Bollwein für die zuverlässige Durchführung der Zellversuche sowie für die engagierte
und sorgfältige Durchführung von HPLC-Analytik und CE-Analytik,
Frau L. Schneider für die engagierte Unterstützung bei der Probenvorbereitung für die HPLC-
Analytik und bei der Durchführung von Enzymaktivitätsmessungen,
Frau K. Röhrl, Herrn O. Baumann und Herrn F. Wiesenmayer für die qualifizierte
Unterstützung bei der Durchführung der Tierversuche,
Frau S. Heinrich, Frau M. Luginger und Herrn P. Richthammer für ihre stete Hilfsbereitschaft
und Unterstützung in vielen organisatorischen und technischen Dingen,

allen Mitarbeitern der analytischen Abteilungen der Fakultät für die Aufnahme der NMR- und
Massenspektren, insbesondere bei Herrn J. Kiermaier und Herrn W. Söllner für die Hilfe bei
der Aufnahme und Auswertung der MALDI-TOF Massenspektren,
meinen Laborkollegen Martin Oettl, Uli Gürtler, Iris Asen, Erich Schneider und Edith
Hofinger für die heitere Atmosphäre im Labor,
den „Hyaluronidase-Forschern“ Martin Oettl, Uli Gürtler, Alexander Botzki, Sunnhild
Salmen, Stephan Braun, Iris Asen, Peter Jarzyna, Edith Hofinger und Martin Spickenreither
für die gute Zusammenarbeit und die zahlreichen fachlichen Diskussionen,
allen Mitgliedern des Lehrstuhls für die Kollegialität und das gute Arbeitsklima.
Besonderer Dank gilt außerdem meiner Familie, auf deren Hilfe und Unterstützung ich mich
immer verlassen konnte.


Contents
Contents
1 Introduction ...................................................................................................................... 1
1.1 Hyaluronic acid.......................................................................................................... 1
1.1.1 Structure and physicochemical properties.......................................................... 1
1.1.2 Occurrence and physiological importance ......................................................... 4
1.1.3 The role of hyaluronan during morphogenesis, tissue regeneration and
tumorigenesis ..................................................................................................... 5
1.2 Hyaluronidases........................................................................................................... 7
1.2.1 History and occurrence....................................................................................... 7
1.2.2 Classification of hyaluronidases......................................................................... 7
1.2.3 Hyaluronidases from eukaryotes........................................................................ 9
1.2.3.1 Mammalian hyaluronidases............................................................................ 9
1.2.3.2 Hyaluronidase from bee venom ................................................................... 12
1.2.4 Hyaluronidases from prokaryotes .................................................................... 14
1.3 Methods for the determination of hyaluronidase activity ........................................ 16
1.3.1 Classical methods............................................................................................. 16
1.3.1.1 Biological methods....................................................................................... 16
1.3.1.2 Physicochemical methods............................................................................ 17
1.3.1.3 Chemical methods........................................................................................ 19
1.3.2 Other methods.................................................................................................. 21
1.4 References................................................................................................................ 22
2 Scope and objectives....................................................................................................... 31
3 Comparative characterisation of bovine testicular hyaluronidase and a hyaluronate
lyase from Streptococcus agalactiae in pharmaceutical preparations ....................... 33
3.1 Introduction.............................................................................................................. 33
3.2 Materials and methods............................................................................................. 34
3.2.1 Chemicals......................................................................................................... 34
3.2.2 Determination of hyaluronidase activity.......................................................... 35
3.2.2.1 Colorimetric method.................................................................................... 35
3.2.2.2 UV difference spectroscopy......................................................................... 35
IContents
®3.2.3 Separation of the basic material of Neopermease by size exclusion
chromatography................................................................................................ 36
3.2.4 Dialysis of the ammonium sulphate precipitate of the hyaluronate lyase........ 37
3.2.5 Determination of protein content ..................................................................... 37
3.2.6 Molecular mass determination......................................................................... 37
3.2.7 Identification of glycosylated proteins............................................................. 37
3.2.8 Identification of IgG......................................................................................... 38
3.2.9 Isoelectric focussing (IEF) ............................................................................... 38
3.2.10 Zymography..................................................................................................... 38
3.2.11 Densitometric analysis..................................................................................... 38
3.2.12 Limited proteolysis of the bacterial enzyme .................................................... 39
3.3 Results and discussion.............................................................................................. 39
® ®3.3.1 Comparison of the pharmaceutical preparations Neopermease and Hylase
“Dessau”........................................................................................................... 39
3.3.1.1 Quantification of enzyme activity................................................................ 39
3.3.1.2 Effect of pH on enzyme activity ..................................................