Comparative analysis of fructosyltransferases of lactobacilli [Elektronische Ressource] / Florian Wolfgang Waldherr

Florian Waldherr

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• Publié par: technische_universitat_munchen
• Publié le: 01 janvier 2009
• Nombre de lectures: 31
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 2 Mo

Extrait

TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN

Lehrstuhl für Technische Mikrobiologie




Comparative analysis of fructosyltransferases of lactobacilli




Florian Wolfgang Waldherr






Vollständiger Abdruck der von der Fakultät
Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung und
Umwelt der Technischen Universität München zur Erlangung des
akademischen Grades eines


Doktors der Naturwissenschaften

genehmigten Dissertation.



Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. Th. F. Hofmann


Prüfer der Dissertation:

1. Univ.-Prof. Dr. R. F. Vogel
2. Univ.-Prof. Dr. S. Scherer



Die Dissertation wurde am 13.07.2009 bei der Technischen Universität
München eingereicht und durch die Fakultät Wissenschaftszentrum
Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung und Umwelt am 11.10.2009
angenommen. II
Wer sich Steine zurechtlegen kann, über die er stolpert,
hat Erfolg in den Naturwisschenschaften.

Erwin Chargaff (*1905), östr.-amerikan.
Biochemiker und Schriftsteller) III
Danksagung

Viele Menschen haben mir bei der Erstellung dieser Doktorarbeit beigestanden. Ihnen sei an
dieser Stelle gedankt.

In erster Linie möchte ich mich bei meinem Doktorvater Prof. Dr. Rudi F. Vogel bedanken:
Für die Aufgabenstellung, für die Möglichkeit die Arbeit an seinem Lehrstuhl anzufertigen
und für die Organisation der Finanzierung. Besonders zu erwähnen ist aber auch die stetige
wertvolle persönliche Unterstützung mit neuen Ideen und Sachverstand. Vielen Dank auch für
die Freiräume, die mir Arbeiten - insbesondere mit Wasserkefir - gestatteten die z. T. weit
über die Zielrichtung dieser Arbeit hinausgingen.

Dank geht auch an Dr. Maher Korakli für die Einführung in das Thema und die wertvolle
Zusammenarbeit im ersten Jahr der Arbeit.

Dr. Daniel Meißner danke ich für die enge Zusammenarbeit und große Unterstützung in den
letzten beiden Jahren meiner Arbeit am Lehrstuhl. Besonderen Dank für die rasche
Einarbeitung in meinen Themenbereich und wertvollen Tips. Dankbar bin ich auch für das
Interesse und den Glauben an den Wasserkefir.

Ein umfassendes Dankeschön geht auch an meine Doktorantenkollegen und alle Mitarbeiter
der Teams für die Unterstützungen in großen und kleinen Dingen. Besonderer Dank gilt hier
den TA Monika Hadek, Eva Bengler, Maggie Schreiber und Georg Mayer. Für die Hilfe in IT
Fragen bedanke ich mich besonders bei Georg Lutterschmidt und für die Einführung in die
Technik der HPLC bei Susanne Kaditzky und Nicoline Vermeulen. Für umfangreiche
technische Tips geht ein besonderer Dank an Jürgen Behr und für anregende Diskussionen an
Holger Teichert

Nicht zuletzt bedanke ich mich bei meinen Eltern dafür, dass sie mir mein Studium ermöglicht
haben und meiner Frau Anna für Vertrauen und Verständnis während der gesamten Studien
und Promotionszeit. Meiner Tochter Liselotte danke ich dafür, mich täglich neu motiviert zu
haben.
IV
Abbrevations
°C degree Celcius
µg microgramme
µl microlitre
aa amino acid
bp base pair(s)
BSA bovine serum albumine
CAPS N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid
coPCR cross over PCR
CPS Capsular polysaccharides
DNA desoxyribo nucleic acid
dNTP desoxy nucleotid triphosphate
DTT dithiothreitol
EDTA ethylendiaminetetraacetic acid
EPS exopolysaccharides
fig figure
FOS fructooligosaccharide
FPLC free presure liquid chromatography
FTF fructosyltransferases
g gramme
GBD Glucan binding domain
GOS glucooligosaccharide
GRAS Generally regarded as safe
GTF glucosyltransferases
h hours
HePS Heteropolysaccharides
HoPS Homopolysaccharides
iPCR inverse PCR
IPTG isopropyl- β-D-thiogalactopyranoside
kbp kilo base pair(s), 1000 base pairs
l litre
LAB Lactic acid bacteria
M molar, mol per litre
mA milliampere
mg milligramme
min minutes
ml millilitre
mM millimolar, millimol per litre
mMRS modified MRS medium
MW molecular weight
OD optical density
OS oligosaccharides
PAGE polyacrylamide gelelectrophoresis
PAS periodic acid-Schiff staining
PCR polymerase chain reaction
pMol picmol per litre
rbs ribosome binding site
rbs e binding site
rpm rounds per minute
s second V
SAP shrimp alkaine phosphatase
SDS sodium dodecyl sulfate, sodium lauryl sulfate
sec second
tab table
TE TRIS-EDTA buffer
TLC thinlayer chromtaography
Tris tris(hydroxymethyl)-aminomethane
U units
UV ultra violett
V Volt
v volume
w weight
VI
Content
1 Introduction ...................................................................................................................... 1
1.1 Lactic acid bacteria and food fermentation....................................................................... 1
1.2 Bacterial Exopolysaccharides ............................................................................................. 2
1.2.1 Basic facts about Polysaccharides................................................................................................... 2
1.2.2 Possible benefits of microbial EPS for the producing organism ..................................................... 3
1.2.3 Possible classifications of EPS........................................................................................................ 3
1.2.3.1 Heteropolysaccharides...........................................................................................................4
1.2.3.2 Homopolysdes............................................................................................................ 4
1.2.3.2.1 Glucans ............................................................................................................................. 5
1.2.3.2.2 Fructans............................................................................................................................. 5
1.3 Glycansucrases – HoPS producing enzymes ..................................................................... 5
1.3.1 GTFs................................................................................................................................................ 6
1.3.2 FTFs..................... 8
1.4 Application of Bacerial EPS in food................................................................................. 13
1.4.1 LAB HePS in milk products.......................................................................................................... 13
1.4.2 LAB HoPS in sourdough products................................................................................................ 13
1.4.3 Problems in HoPS application in food .......................................................................................... 14
1.5 Aim of this study ................................................................................................................ 15
2 Material and Methods.................................................................................................... 16
2.1 Materials ............................................................................................................................. 16
2.1.1 Devices.......................................................................................................................................... 16
2.1.2 Chemicals................ 17
2.1.3 Bacterial strains............... 20
2.1.4 Primer............................................................................................................................................ 20
2.1.5 Restriction enzymes ...................................................................................................................... 22
2.1.6 Plasmids ........................................................................................................................................ 23
2.2 Methods....... 25
2.2.1 Microbiological methods............................................................................................................... 25
2.2.1.1 Media................................................................................................................................... 25
2.2.1.2 Cultivation parameters......................................................................................................... 25
2.2.1.3 Screening for EPS formation ............................................................................................... 26
2.2.1.4 DNA isolation from lactobacilli .......................................................................................... 26
2.2.1.5 Production of chemical competent cells and transformation protocol................................. 27
2.2.2 EPS treatment................................................................................................................................ 28
2.2.2.1 EPS precipitation ..................................................................................................