Complex formation of AID and its function in innate immunity [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Mirjam Metzner

Mirjam Pressler

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• Publié par: friedrich-alexander-universitat_erlangen-nurnberg
• Publié le: 01 janvier 2010
• Nombre de lectures: 12
• Langue: English
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Extrait

Complex Formation of AID and its Function in Innate Immunity



Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades









vorgelegt von
Mirjam Metzner
aus Würzburg





Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Universität Erlangen-Nürnberg















Tag der mündlichen Prüfung: 05. Juli 2010
Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. E. Bänsch
Erstberichterstatter: Prof. Dr. H.-M. Jäck
Zweitberichterstatter: Prof. Dr. T. Winkler








FOR MY PARENTS

Table of Contents
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TABLE OF CONTENTS

1 ZUSAMMENFASSUNG 1
SUMMARY 2
2 INTRODUCTION 3
2.1 Adaptive and innate immunity 3
2.2 B cell development and activation 3
2.3 Activation-induced cytidine deaminase (AID) 4
2.3.1 AID in adaptive immunity 4
2.3.2 Basic facts about AID 5
2.3.3 APOBEC family of cytidine deaminases 6
2.3.4 AID cofactors 8
2.3.5 AID multimers and complexes 8
2.3.6 AID and RNA 9
2.3.7 AID deficiency and autoimmune disease 10
2.3.8 AID in innate immunity 11
2.3.8.1 AID protects from viral infection 11
2.3.8.2 AID inhibits L1 retrotransposition 12
2.4 Endogenous retroelements 13
2.4.1 L1 elements 13
2.4.1.1 The L1 retrotransposition cycle 14
2.4.1.2 Expression pattern 15
2.4.1.3 Restriction of L1 activity 15
2.4.2 Retroelements and autoimmune disease 15
3 SPECIFIC AIMS 17
4 RESULTS 18
4.1 Set-up of cell systems for endogenous and exogenous AID
protein expression 18
4.2 Antibodies against AID 20
4.2.1 Comparison of existing AID specific antibodies 21
4.2.2 Generation of new monoclonal AID specific antibodies 23
4.3 Two forms of AID differing in their ability to bind agarose 26
I Table of Contents
________________________________________________________________________
4.3.1 Two AID variants within a cell: one binds to agarose, the other one
does not 26
4.3.2 AID binding to agarose is not RNase-sensitive 29
4.3.3 AID expressed in E. coli features similar agarose binding
characteristics 30
4.3.4 Conclusion 30
4.4 AID forms high molecular mass complexes in the cytoplasm 31
4.4.1 Size exclusion fractionation of AID-positive cell lysates 31
4.4.2 Inhibition of nuclear export and proteasome degradation of AID 33
4.4.3 Protein degradation during fractionation as a consequence of
RNase treatment 34
4.4.4 Composition of large and medium AID protein complexes 36
4.4.5 Co-immunoprecipitation with AID to identify AID complex components 38
4.4.6 Purification of AID complexes via ion exchange chromatography 40
4.4.7 Agarose binding of high and medium molecular mass AID complexes 42
4.5 Another function of AID—innate immunity to endogenous
retroelements 43
4.5.1 AID binds to L1 mRNA but not to sterile germ line transcripts 43
4.5.2 AID decreases L1 protein level 46
4.5.2.1 ORF1 protein level in primary mouse B cells 46
4.5.2.2 ORF1 protein level in human cell lines 47
4.5.2.3 ORF1 protein level in B cells of AID-deficient patients 48
4.5.2.4 ORF1 protein degradation during FPLC fractionation 49
4.5.3 AID binds to ORF1 protein 51
4.5.4 L1 mRNA is not increased in AID-deficient B cells 51
4.6 AID and autoimmune disease 52
4.7 Human APOBEC3 (hA3) transgenic mice and L1 retroelements 55
4.7.1 A3G forms HMM and LMM complexes in hA3 transgenic mice 55
4.7.2 A3G and ORF1 protein level in hA3 transgenic mice 57
5 DISCUSSION 58
5.1 Agarose binding of AID—caveats and relevance 58
5.2 AID complexes—isolation and identification of their components 59
II Table of Contents
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5.3 AID suppresses endogenous retroelements—the underlying
mechanism 60
5.4 AID mediates innate immunity 61
5.4.1 AID protects from autoimmunity by suppressing retroelements 62
5.4.1.1 Causes of autoimmunity 62
5.4.1.2 AID, retroelements and autoimmunity 63
5.4.1.3 Absence of AID causes autoimmunity—how it may work 63
5.4.1.4 Absence of AID causes autoimmunity—how to prove it 64
5.4.2 AID protects from tumorigenesis by suppressing retroelements 65
5.5 AID complexes—associated with P bodies and stress granules? 65
5.6 Significance of this study 67
6 MATERIALS AND METHODS 69
6.1 Materials 69
6.1.1 Oligonucleotides 69
6.1.1.1 Primer for cloning 69
6.1.1.2 Primer for sequencing 69
6.1.1.3 Primer for RT-PCR 70
6.1.1.4 Primer for genotyping PCR 70
6.1.2 Plasmids 71
6.1.3 Eukaryotic cells 73
6.1.3.1 Cell lines 73
6.1.3.2 Primary cells 74
6.1.4 Antibodies 74
6.1.5 Mouse strains 76
6.2 Methods 77
6.2.1 Nucleic acids 77
6.2.1.1 Isolation of nucleic acids 77
a) RNA extraction 77
b) DNA extraction 77
6.2.1.2 cDNA synthesis 78
6.2.1.3 Polymerase chain reaction (PCR) 79
a) PCR using genomic and plasmid DNA 79
b) (Semiquantitative) RT-PCR 79
c) Quantitative real-time RT-PCR (QRT-PCR) 80
III Table of Contents
________________________________________________________________________
6.2.1.4 Detection of nucleic acids 81
6.2.1.5 Cloning 81
6.2.1.6 Sequencing 82
6.2.2 Cells 83
6.2.2.1 Cell culture of mammalian cells 83
6.2.2.2 Isolation of splenic cells 84
6.2.2.3 AID induction in primary B cells 84
6.2.2.4 AID induction in stable HeLa and 18-81 cell transfectants 84
6.2.2.5 Transfection of eukaryotic cells 85
a) Stable transfection 85
b) Transient transfection 85
6.2.2.6 Production of retroviral supernatant and infection of primary B cells 86
6.2.3 Protein 86
6.2.3.1 Protein lysates 86
6.2.3.2 SDS PAA gel electrophoresis (SDS-PAGE) and western blot analysis 87
6.2.3.3 Protein staining of PAA gels 89
a) Coomassie blue staining 89
b) SYPRO Ruby staining 90
c) Silver staining 91
6.2.3.4 Agarose binding assay 92
6.2.3.5 (Co-) Immunoprecipitation 93
6.2.3.6 Tandem-affinity purification (TAP) 93
6.2.3.7 RIP assay (= RNA-IP) 97
6.2.3.8 ELISA 98
6.2.3.9 Flow cytometry 99
6.2.3.10 Immunofluorescence staining 100
6.2.3.11 Fast protein liquid chromatography (FPLC) 101
a) Size exclusion chromatography (= gel filtration chromatography) 101
b) Ion exchange chromatography 103
6.2.3.12 Generation of monoclonal antibodies 105
7 REFERENCES 106
8 ABBREVIATIONS 121
9 CURRICULUM VITAE 125
IV Table of Contents
________________________________________________________________________
10 PRESENTATIONS AND PUBLICATIONS 127
11 ACKNOWLEDGMENTS 128

V 1 Zusammenfassung
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1 ZUSAMMENFASSUNG

Aktivierungsinduzierte Cytidin-Deaminase (AID) gehört zur APOBEC-Protein-Familie
und ist ein B-Zell-spezifischer Mutator, der Cytosin zu Uracil in DNA, und
möglicherweise auch RNA desaminiert. Familienmitglieder von AID vermitteln
angeborene Immunität, indem sie vor Retroviren und Retroelementen schützen; AID
hingegen ist bekannt für seine Funktion in adaptiver Immunität bei der Erzeugung des
sekundären Antikörperrepertoires in B-Zellen des Keimzentrums. Nach Antigen-
vermittelter B-Zell-Aktivierung leitet AID somatische Hypermutation sowie den
Klassenwechsel von Immunglobulingenen ein – das bringt hoch spezifische Antikörper
mit unterschiedlichen Effektorfunktionen hervor. Das Ziel meiner Doktorarbeit bestand
darin zu untersuchen, ob AID seinen APOBEC3 Familienmitgliedern funktionell ähnlich
ist in Bezug auf das Vermitteln von angeborener Immunität. APOBEC3G bildet
zytoplasmatische Komplexe aus, die Retroelemente enthalten und inaktivieren. Die
spezifische Aufgabenstellung war es zu untersuchen, ob AID auch Komplexe bildet, und
wenn ja, welche Funktion und Zusammensetzung diese haben. Um diese Fragestellung
zu beantworten, habe ich Immunpräzipitationen mit Agarose-Beads durchgeführt und
kam zu meinem ersten Ergebnis: es gibt zwei Formen von AID – eine bindet an
Agarose, die andere nicht. In anschließenden Experimenten habe ich gezeigt, dass AID
in primären B-Zellen endogene L1-Retroelemente inhibiert, indem es hochmolekulare
Komplexe mit deren mRNA- und Proteinprodukten bildet. Abwesenheit von AID hat eine
stark erhöhte Expression von L1-Retroelementen zur Folge. Im Einklang mit Daten aus
den letzten Jahren, nach denen endogene Retroelemente Autoimmunerkrankungen
verursachen können, erklären meine Ergebnisse möglicherweise, warum AID-defiziente
Mäuse und Patienten unter lymphoider Hyperplasie und Autoimmunerkrankungen
leiden. Ich postuliere, dass AID angeborene Immunität vermittelt, indem es B-Zellen vor
nachteiligen Retroelement-E