Cytomegalovirus specific activation of cytotoxic T-lymphocytes by chimeric immunoreceptors [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Florian Sebastian Full

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Cytomegalovirus specific activation of cytotoxic T lymphocytes by chimeric immunoreceptors Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades vorgelegt von Florian Sebastian Full aus Nürnberg Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 12.01.2010 Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch Erstberichterstatter: Prof. Dr. Lars Nitschke Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Bernhard Fleckenstein Contents Contents 1 Sumary 1 1.1 Zusammenfassung 1 1.2 Summary 2 2 Introduction 3 3 Rationale of the thesis 10 4 Material and methods 11 4.1 Materials 11 4.1.1 Cells 4.1.2 Bacteria and viruses 11 4.1.3 Vectors 12 4.1.4 Chemicals 13 4.1.5 Oligonucleotides 14 4.1.6 Antibodies 15 4.1.7 Buffers and solutions 16 4.1.8 Markers for electrophoresis 16 4.1.9 Media bacterial cultures 4.1.10 Reagents and media for eukaryotic cell culture 17 4.2 Methods 17 4.2.1 Standard methods 17 4.2.2 Preparation of viral DNA 17 4.2.3 Cell culture 18 4.2.4 Transfection of 293Tcells 18 4.2.

Sujets

• Biologie

Informations

• Publié par: friedrich-alexander-universitat_erlangen-nurnberg
• Publié le: 01 janvier 2010
• Nombre de lectures: 15
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 3 Mo

Extrait

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Cytomegalovirus specific activation of cytotoxic T lymphocytes by chimeric immunoreceptors

Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades        vorgelegt von Florian Sebastian Full  aus Nürnberg

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Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Universität Erlangen-Nürnberg         Tag der mündlichen Prüfung:  Vorsitzender der Promotionskommission:  Erstberichterstatter:  Zweitberichterstatter: 

12.01.2010

Prof. Dr. Eberhard Bänsch

Prof. Dr. Lars Nitschke

Prof. Dr. Bernhard Fleckenstein

Contents

  Contents 1 Summary 1.1 Zusammenfassung 1.2 Summary 2 Introduction 3 Rationale of the thesis 4 Material and methods 4.1 Materials 4.1.1 Cells 4.1.2 Bacteria and viruses 4.1.3 Vectors 4.1.4 Chemicals 4.1.5 Oligonucleotides 4.1.6 Antibodies 4.1.7 Buffers and solutions 4.1.8 Markers for electrophoresis 4.1.9 Media for bacterial cultures 4.1.10 Reagents and media for eukaryotic cell culture 4.2 Methods 4.2.1 Standard methods 4.2.2 Preparation of viral DNA 4.2.3 Cell culture 4.2.4 Transfection of 293Tcells 4.2.5 Production of lentiviral vectors and lentiviral transduction 4.2.6 RNA in vitro transcription (ivt) 4.2.7 Electroporation of in vitro transcribed RNA 4.2.8 Cloning of the chimeric immunoreceptors 4.2.9 Homologous recombination inE.coli  4.2.10 Quantitative real time PCR from HCMV containing supernatant 4.2.11 Luciferase assays 4.2.12 Immunofluorescence analysis  4.2.13 Flow cytometric analysis 4.2.14 Western Blot 4.2.15 Cytokine ELISA

1  1  2  3 10 11 11 11 11 12 13 14 15 16 16 16 17 17 17 17 18 18 18 19 19 20 20 20 21 21 21 22 22

 Contents  4.2.16 CTL expansion 4.2.17 Cytotoxicity Assay 5 Results 5.1 Chimeric immunoreceptors 5.2 HCMV replication kinetics 5.3Herpesvirus saimiri  5.4 Lentiviral transduction 5.4.1 Lentiviral transduction of Jurkat T cells 5.4.2 Lentiviral transduction of primary human T cells 5.5 Function of lentivirally transduced T cells 5.5.1 NFAT reporter assays 5.5.2 Expansion of transduced T cells by receptor activation 5.5.3 Antiviral activity of lentivirally gB-cIR engrafted T cells 5.6 Electroporation ofin vitrotranscribed RNA 5.7 Function of cIR electroporated T cells 5.7.1 Chimeric immunoreceptor targeting HCMV gH 5.7.2 Chimeric immunoreceptors targeting HCMV gB 6 Discussion Abbreviations References 

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Summary

  1 Summary 1.1 Zusammenfassung Nach hämatopoietischer Stammzelltransplantation führt die Infektion mit dem humanen Cytomegalovirus (HCMV), oder die Reaktivierung von latentem Virus, zu erheblichen Komplikationen und ist trotz der spezifischen pharmakologischen antiviralen Prophylaxe und Therapie mit einer erhöhten Sterblichkeit assoziiert. Die adoptive Immuntherapie mit Hilfe Virus-spezifischer, zytotoxischer T-Zellen ist eine zwar aufwendige aber erfolgversprechende Alternative zur Behandlung einer Virus-Reaktivierung. Dieses Vorgehen ist jedoch in der Hochrisikosituation eines HCMV-positiven Stammzellempfängers und eines HCMV- negativen Stammzellspenders kaum durchführbar. Das Ziel dieser Arbeit war es, modifizierte humane Effektor-T-Zellen zu generieren, um HCMV Infektionen auch in Hochrisikopatienten behandeln zu können. Es konnte gezeigt werden, dass die viralen Glykoproteine B und H (gB und gH) auf der Oberfläche von infizierten Zellen exprimiert werden, noch bevor aus infizierten Zellen Viruspartikel in den Überstand freigesetzt werden. Diese Glykoproteine dienten als Ziel für chimäre Immunorezeptoren (cIR), welche extrazellulär aus Teilen eines Antikörpers und intrazellulär aus signalübertragenden Einheiten des T-Zell-Rezeptorkomplexes bestehen. Die Expression dieser cIRs in T-Zellen vermittelt eine HLA-unabhängige Antigenerkennung mit nachfolgender T-Zellaktivierung. Verschiedene Ansätze zur Expression von cIRs in primären humanen T-Zellen wurden verglichen. Während eine aufHerpesvirus saimiri basierte Methode nicht zur stabilen Rezeptorexpression führte, konnten sowohl mit Hilfe von HIV-abgeleiteten, lentiviralen Vektoren als auch durch Elektroporation vonin vitro RNA erfolgreich transkribierter T-Zellen mit einer zusätzlichen Spezifität ausgestattet werden. Von den fünf verschiedenen getesteten Rezeptoren erwies sich mindestens einer als funktionell. Derartige, gegen das HCMV Glykoprotein B gerichtete, Rezeptor-tragende T-Zellen produzierten IFNγ TNF und nach Koinkubation mit infizierten Fibroblasten. Sie proliferierten nach Antigen-spezifischer Stimulation und lysierten Glykoprotein B exprimierende Zellen sehr effizient. Die Interaktion zwischen T-Zelle und Virus-infizierter Zielzelle wurde HLA-unabhängig vermittelt, und es konnte die erfolgreiche Aktivierung auch von T-Zellen aus HCMV-naiven Spendern nachgewiesen werden. Redirigierte, HCMV-spezifische T-Zellen eröffnen eine neue Perspektive für die adoptive Immuntherapie der HCMV Infektion nach Stammzelltransplantation.

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