Die Interaktion zwischen dem Transkriptionsfaktor FoxO1a und der Proteinkinase DYRK1 und ihre Bedeutung bei der Regulation des Glucose-6-Phosphatasegens [Elektronische Ressource] / vorgelgt von Florian Till von Groote-Bidlingmaier

Oem

Sujets

• Gesundheit

Informations

• Publié par: rheinisch-westfalischen_technischen_hochschule_-rwth-_aachen
• Publié le: 01 janvier 2007
• Nombre de lectures: 22
• Langue: Deutsch

Extrait

Die Interaktion zwischen dem Transkriptionsfaktor FoxO1a und der Proteinkinase DYRK1 und ihre Bedeutung bei der Regulation des Glucose-6-Phosphatasegens

Von der Medizinischen Fakultät der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Medizin genehmigte Dissertation

vorgelegt von Florian Till von Groote-Bidlingmaier aus Neuss

Berichter: Herr Universitätsprofessor Dr. rer. nat. Dr. med. Hans Georg Joost Herr Universitätsprofessor Dr. rer. nat. Peter C. Heinrich

Tag der mündlichen Prüfung: 19. Dezember 2007

Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.

Wesentliche Teile der vorliegenden Arbeit wurden publiziert in:

Groote-Bidlingmaier, F., Schmoll, D., Orth, H.M., Joost, H.G., Becker, W., and

Barthel, A. (2003). DYRK1 is a co-activator of FKHR (FOXO1a)-dependent

glucose-6-phosphatase gene expression. Biochem. Biophys. Res. Commun.

300, 764-769.

Inhalt 1 Einleitung..........................................................................................................1 1.1 Einführung in die Epidemiologie und Pathophysiologie des Typ 2- Diabetes...................................................................................................1 1.2 Die Glucoseproduktion der Leber .....................................................2 1.3 Signaltransduktion des Insulinrezeptors............................................4 1.4 Der Transkriptionsfaktor FoxO1a und seine Rolle bei der Regulation des Glucose-6-Phosphatasegens............................................................6 1.5 Die Familie der DYRK Kinasen und ihre Verbindung mit dem Transkriptionsfaktor FoxO1a....................................................................9 1.7 Arbeitshypothese und Zielsetzung...................................................11 2 Materialien und Methoden............................................................................12 2.1 Konstrukte........................................................................................12 2.1.1 Der Promotor des Glucose-6-Phosphatasegens......................12 2.1.2 FoxO1a Wildtyp.........................................................................12 2.1.3 FoxO1a Ser329-Punktmutanten...............................................12 2.1.3.1 FoxO1a Ser329Ala-Mutante..................................................12 2.1.3.2 FoxO1a Ser329Asp-Mutante.................................................13 2.1.4 IRU-Mutante des Glucose-6-Phosphatasereportergens...........13 2.1.5 DYRK-Konstrukte......................................................................14 2.2 Zellbiologische Arbeitstechniken.....................................................15 2.2.1 Zelllinien....................................................................................15 2.2.1.1 Medien und allgemeine Kulturbedingungen..........................15 2.2.1.2 Subkultivierung.......................................................................15 2.2.2 Transfektion...............................................................................16 2.2.3 Retroviraler Gentransfer............................................................17 2.2.4 Selektionierung der infizierten Zellen........................................18 2.3 Proteinchemische Arbeitstechniken.................................................19 2.3.1 SDS-PAGE................................................................................19 2.3.1.1 Gelherstellung........................................................................19 2.3.1.2 Probenvorbereitung................................................................21 2.3.1.3 Proteinbestimmung (BCA-Methode)......................................21 2.3.1.4 Gelelektrophorese..................................................................22 2.3.2 Western-Blotting und ECL-System...........................................22

I

2.3.2.1 Transfer..................................................................................22 2.3.2.2 Inkubation mit Antikörpern.....................................................22 2.3.3 Ponceau-Färbung......................................................................23 2.4 Molekularbiologische Arbeitstechniken...........................................24 2.4.1 DNA-Präparation.......................................................................24 2.4.1.1 Minipräparation.......................................................................24 2.4.1.2 Präparation größerer DNA-Mengen ......................................24 2.4.2 Restriktionsverdau.....................................................................25 2.4.3 Herstellung kompetenter E. coli-Bakterien................................25 2.4.4 Transformation von E.coli-Bakterien.........................................26 2.4.4.1 Hitzeschocktransformation.....................................................26 2.4.4.2 Elektroporation.......................................................................27 2.4.5 DNA-Agarosegelelektrophorese...............................................27 2.4.6 Sequenzspezifische Mutagenese.............................................28 2.4.7 DNA-Sequenzierung.................................................................29 2.4.8 Northern Blotting ......................................................................31 2.4.8.1 RNA-Isolierung.......................................................................31 2.4.8.2 RNA-Agarosegelelektrophorese............................................31 2.4.8.3 Blotting....................................................................................32 2.4.8.4 Aufreinigen der DNA-Sonden nach Gelelektrophorese.........33 2.4.8.5 Markieren einer Sonde mit [32P]...........................................33 2.4.8.6 Hybridisierung der Northern Blots..........................................34 2.4.9 Reportergen-Assay (Luciferase)...............................................34 2.5 Statistische Analyse.........................................................................34 3 Ergebnisse......................................................................................................35 3.1 Effekte von überexprimiertem DYRK1A auf den Gehalt an Glucose-6-Phosphatase-mRNA und die Aktivität des G6Pase- Promotors in Hepatomzellen..................................................................35 3.1.1 Überexpression von DYRK1A in stabil transfizierten Rattenhepatomzellen.........................................................................35 3.1.2 Der Einfluss von stabil transfiziertem DYRK1A auf die endogene Glucose-6-Phosphatase-mRNA in Rattenhepatomzellen 36 3.1.3 Der Effekt von DYRK1A auf die Promotoraktivität des Glucose-6-Phosphatasegens im Reportergen-Assay........................37

II

3.2 Der Effekt von DYRK1A auf die G6Pase-Promotoraktivität in Abhängigkeit von der DYRK1A-Kinaseaktivität.....................................40 3.2.1 Der Einfluss von FoxO1a-Ser329-Punktmutanten auf die durch DYRK1A vermittelte Expression des Glucose-6-Phosphatasegens..40 3.2.2 Der Effekt einer katalytisch inaktiven DYRK1A-Punktmutante auf den Glucose-6-Phosphatase-Promotor.......................................43 3.3 Untersuchungen zu Effekten verschiedener DYRK-Isoformen auf die Aktivität des Glucose-6-Phosphatase-Promotors............................44 3.4 Die Effekte unterschiedlicher DYRK-Isoformen auf die FoxO1a- induzierte Aktivität des Glucose-6-Phosphatase-Promotors.................45 3.5 Der Effekt von DYRK1 auf den Glucose-6-Phosphatase-Promotor in Abhängigkeit von FoxO1a-Bindungsstellen (IRUs)...............................47 4 Diskussion......................................................................................................49 5 Zusammenfassung........................................................................................55 6 Literaturverzeichnis.......................................................................................56

III