Fluorescence tagging of herpes simplex virus type 1 proteins by mutagenesis of a bacterial artificial chromosome [Elektronische Ressource] / von Claus-Henning Nagel

Claus-Henning Nagel

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• Publié par: gottfried_wilhelm_leibniz_universitat_hannover
• Publié le: 01 janvier 2006
• Nombre de lectures: 32
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 13 Mo

Extrait

Fluorescence tagging of
herpes simplex virus type 1
proteins by mutagenesis of a
bacterial artificial chromosome





Von der naturwissenschaftlichen Fakultät der
Gottfried Wilhelm Leibnitz Universität Hannover
zur Erlangung des Grades


Doktor der Naturwissenschaften
Dr. rer. nat.


genehmigte Dissertation

von



Claus-Henning Nagel
Diplom-Biochemiker


geboren am 13.02.1977 in Hannover




2006Referentin: HD Dr. Beate Sodeik
Korreferent: PD Dr. Gert Zimmer
Tag der Promotion: 14.07.2006





„Die Einsicht oder Ansicht, daß das Vollkommene und die
Wissenschaft Stückwerk ist, darf niemand daran hindern, doch
stets weiterzubauen und eben doch das Mögliche zu erreichen.“

Hermann Hesse
(Lektüre für Minuten. Auswahl und zus. v. Volker Michels. Suhrkamp, Frankfurt/M., 1971, 1997)









Für Omi
3Contents
Danksagung............................................................................................................................5
Abbreviations .........................................................................................................................6
Abstract...................................................................................................................................8
Zusammenfassung.................................................................................................................9
1. Introduction...................................................................................................................10
1.1. Herpesviruses.........................................................................................................10
1.2. Herpes simplex virus type 1....................................................................................11
1.3. HSV1 replication.....................................................................................................17
1.4. Mutagenesis of herpesviruses................................................................................24
1.5. Aim of the thesis40
2. Materials........................................................................................................................41
2.1. Laboratory equipment.............................................................................................41
2.2. Microscopes ...........................................................................................................42
2.3. Consumables..........................................................................................................42
2.4. Kits..........................................................................................................................42
2.5. Chemicals...............................................................................................................43
2.6. Electrophoresis standards ......................................................................................46
2.7. Enzymes.................................................................................................................46
2.8. Media and solutions................................................................................................47
2.9. Antibodies49
2.10. Oligonucleotides .....................................................................................................49
2.11. Organisms and plasmids ........................................................................................51
3. Methods.........................................................................................................................59
3.1. Eukaryotic cell culture.............................................................................................59
3.2. Virological techniques59
3.3. Molecular biological techniques..............................................................................64
3.4. BAC mutagenesis...................................................................................................70
3.5. Transfection of eukaryotic cells72
3.6. Light microscopy.....................................................................................................73
3.7. SDS-PAGE and Western-blotting...........................................................................73
4. Results...75
+4.1. Cloning of HSV1(17 ) as a BAC .............................................................................75
4.2. Tagging of VP26 with a fluorescent protein............................................................95
4.3. HSV1-gD with a fluorescent protein....................................................126
5. Discussion ..................................................................................................................134
5.1. BAC-Cloning of HSV1 ..........................................................................................134
5.2. HSV1 encoding a fluorescence-tagged VP26 ......................................................141
5.3. Dual coloured HSV1 virions..................................................................................147
5.4. Outlook .................................................................................................................149
6. Literature.....................................................................................................................151
Lebenslauf.....164
Publikationen....165
Erklärung zur Dissertation ................................................................................................166
4Danksagung
Danksagung
Viele Personen haben zum Gelingen dieser Doktorarbeit maßgeblich beigetragen oder mir
die Arbeit erleichtert. Allen, die diese Arbeit Korrektur gelesen haben, sei an dieser Stelle
nochmals gedankt.
Ich danke PD Dr. Beate Sodeik für die Begutachtung dieser Arbeit und ihre professionelle
Betreuung während dieses herausfordernden Projektes. Ihr persönlicher Einsatz, ihre
Anerkennung von Erfolgen und ihr Ansporn bei Rückschlägen haben mir sehr geholfen, auch
den einen oder anderen Fehler meinerseits als lehrreich hinzunehmen. In vielen
Diskussionen konnte ich eine große Einsicht in wissenschaftliche Denk- und Arbeitsweisen
erlangen.
Ich bedanke mich bei PD Dr. Gert Zimmer für die Übernahme des Korreferates dieser Arbeit.
Prof. Martin Messerle und Dr. Eva Borst waren und sind mir als Experte und Expertin auf
dem Gebiet der BAC-Mutagenese stets zur Hilfe. In vielen Diskussionen konnte ich eine
Menge lernen. Ihnen gilt mein Dank, ebenso Nadine Müther, mit der ich die gemeinsamen
Erfahrungen auf dem Gebiet der HSV1-BAC-Mutagenese austauschen konnte.
Ich habe im Jahre 2002 dieses Projekt von Dr. Tanja Strive übernommen und konnte nahtlos
an ihre Vorarbeiten anknüpfen, somit trug auch sie einen erheblichen Anteil zum Gelingen
dieser Arbeit bei.
Dank an alle Kollegen, die mir wertvolle Informationen und Reagenzien zur Verfügung
gestellt haben.
Vielen Dank an Mojgan Fathollahy für ihre Hilfe bei der täglichen molekularbiologischen
Routine- und Kniffelarbeit, ebenso an Heidi Pommer für den freundlichen Sequenzierungs-
service. Danke an Ute Prank für ihre gewissenhafte Pflege der Zellkultur und ihre Hilfe im
Laboralltag.
Meinen vielen Kolleginnen und den wenigen Kollegen aus dem Sodeik-Labor sei für die
herzliche und erfrischende Arbeitsatmosphäre gedankt. Es macht Spaß, mit Euch zu
arbeiten! In Zukunft gibt es auch wieder mehr Laborstammtische, versprochen!
Allen Kolleginnen und Kollegen des Instituts für Virologie der MHH danke ich für das
kooperative und kollegiale Arbeitsklima.
Ich danke meinen lieben Eltern und meiner Familie für ihre stete Unterstützung, die ich
während meines Studiums und meiner Doktorarbeit erfahren habe.
Danke Wibke, dass Du immer für mich da bist!
5Abbreviations
Abbreviations

Amino acids and nucleic acids are abbreviated as proposed by the IUPAC-IUB Joint
Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN).

% (w/v) weight per volume
% (v/v) volume per volume
aa amino acid
AdV adenovirus
R Amp ampicillin resistance
app. approximately
ATP adenosinetriphosphate
BAC bacterial artificial chromosome
BHV bovine herpesvirus
Rbla β-lactamase (Amp )
bp basepair(s)
Rcat chloramphenicol acetyl transferase (Cm )
CFP cyan fluorescent protein
R Cm chloramphenicol resistance
(H)CMV (human) cytomegalovirus
CPE cytopathic effect
Da Dalton
dATP desoxyadenosinetriphosphate
dCTP desoxycytidinetriphosphate
dGTP desoxyguanosinetriphosphate
DIG dioxygenin
DMSO dimethyl sulfoxide
DNA desoxyribonucleic acid
DR direct repeat
dsDNA double-stranded DNA
dTTP desoxythymidinetriphosphate
e.g. exempli gratia (for example)
EBV Epstein-Barr virus
ER endoplasmic reticulum
FCS fetal calf serum
FITC fluorescein thioisocyanate
FP fluorescent protein
6Abbreviations
GFP green fluorescent protein
gX