Gene expression profiling of human lymph node-positive gastric adenocarcinomas [Elektronische Ressource] : towards personalized prognosis and therapy / Susann Förster. Gutachter: Hanspeter Herzel ; Wolfgang Kemmner ; Reinhold Schäfer

Sfoerst

Sujets

• Gesundheit

Informations

• Publié par: humboldt-universitat_zu_berlin
• Publié le: 01 janvier 2011
• Nombre de lectures: 176
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 27 Mo

Extrait

Gene expression profiling of
human lymph node-positive gastric
adenocarcinomas:
‒Towards personalized prognosis and therapy ‒



Dissertation


zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Dipl.-Ernähr. Susann Förster
geb. am 07.06.1980 in Leipzig

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin:
Prof. Dr. Dr. h.c. Christoph Markschies

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I:
Prof. Dr. Lutz-Helmut Schön



Gutachter: 1. Prof. Dr. Hanspeter Herzel
2. Dr. habil. Wolfgang Kemmner
3. Prof. Dr. Reinhold Schäfer

Tag der mündlichen Prüfung: 23.09.2010 Zusammenfassung

Histologisch werden zwei Haupttypen des Magenkarzinoms unterschieden, diffu-
se und intestinale Adenokarzinome. Beide Typen haben verschiedene Ätiologien,
Abfolgen der Karzinogenese und Progression und im Zusammenhang damit ver-
schiedene molekulare Profile.
Um den molekularen Hintergrund und das Verhalten beider Typen tiefgehender
zu analysieren, wurden in der hier vorgelegten Arbeit globale Genexpressionspro-
file mittels Affymetrix Microarray-Technik erstellt. Der intestinale Typ konnte als
stark proliferierender Tumor mit signifikanter Überexpression von zellzyklus- und
mitoserelevanten Genen definiert werden, während der diffuse Typ als stark stro-
maabhängig mit signifikanter Überexpression von Genen der extrazellulären Mat-
rix hervortrat. Thrombospondin 4 (THBS4) wurde dabei als das am stärksten dif-
ferentiell exprimierte Gen identifiziert. Es wird in diffusen Tumoren eminent
überexprimiert, während keine Expression in intestinalen Tumoren zu verzeichnen
ist. Immunhistochemische Studien bestätigten diese starke Überexpression auf
Proteinebene und zeigten, dass THBS4 eine übermäßig angereicherte extrazellulä-
re Komponente des Tumorstromas ist. Intrinsische Expression von THBS4 in „ge-
sundem“ Magenepithel und -stroma konnte nicht festgestellt werden. Kolokalisie-
rungsstudien zeigten zudem, dass THBS4-positive Zellen auch positiv für
Vimentin und α-Smooth muscle actin sind. Diese Ergebnisse belegen, dass
THBS4 von Subpopulationen Tumor-assoziierter Fibroblasten (TAF) exprimiert
und sezerniert wird. Dies konnte durch zusätzliche in vitro Experimente bestätigt
werden, die aufzeigten, dass TAF von diffusen Tumoren eine ausgeprägtere
THBS4-mRNA Expression aufweisen als normale Fibroblasten des Magens glei-
cher Patienten. Abschließend konnte in in vitro Kokultur-Studien aufgedeckt wer-
den, dass die THBS4-Expression in Fibroblasten durch Tumorzellen diffuser Ma-
genadenokarzinome transkriptionell stimuliert und erhöht wird. Die vorliegende
2Arbeit ist die erste, die THBS4 im Szenario diffuser Magenadenokarzinome be-
schreibt und charakterisiert.
Metastasenbefall regionaler Lymphknoten (N+) ist bei den meisten Magenadeno-
karzinomdiagnosen bereits vorhanden. Dieser ist der stärkste derzeit verfügbare
Parameter zur Abschätzung der Prognose und Wahl der Therapie. Allerdings
reicht er allein für eine eindeutige Prognosebestimmung nicht aus. Um ergänzende
molekulare Prognoseindikatoren zu identifizieren, wurden aus den Microarray-
Daten dieser Studie Gene, deren Expression mit dem klinischen Verlauf von N+
Patienten korreliert, extrahiert. Einige der ermittelten Gene, wie RAN binding
protein 17, homeobox C10, ras-related associated with diabetes und folate recep-
tor 1, konnten mittels quantitativer real-time PCR als prognoserelevant validiert
werden. Eine signifikante Stratifizierung der N+ Patienten bezüglich progressi-
onsfreiem Überleben war anhand der Expression dieser Gene möglich. Solche
molekularen Marker oder Signaturen können in Zukunft dazu dienen, spezifische-
re personenbezogene Prognosevorhersagen zu treffen und auf diese Weise eine
auf den jeweiligen Patienten optimierte Therapie auszuwählen.

Schlagworte: Genexpressionsprofilierung, Magenadenokarzinom, Tumor-
stroma, extrazelluläre Matrix, Tumor-assoziierte Fibroblasten, N-Stadium,
klinischer Verlauf, Prognose















3Abstract

According to histology, two major subtypes of gastric cancer can be distin-
guished, diffuse and intestinal-type adenocarcinomas. They are assumed to have
distinct etiologies, follow different pathways of carcinogenesis and progression
and, along with that, possess different molecular profiles.
To work towards a better understanding of each type’s molecular background and
biological behavior, global gene expression profiles were established in the work
presented here, using the Affymetrix microarray technique. The intestinal type
was identified to be a highly proliferative entity with significant overexpression of
cell cycle and mitosis-relevant genes, whereas the diffuse type was proven to be
strongly stroma-dependent with significant overexpression of extracellular matrix
genes. Thrombospondin 4 (THBS4) was identified as the gene most differentially
expressed between the two types. It is vastly overexpressed in diffuse-type tu-
mors, whereas intestinal tumors lack its expression. Immunohistochemical studies
proved overexpression on protein level and elucidated that THBS4 is a heavily
accumulated extracellular constituent of the tumor stroma. Intrinsic THBS4 ex-
pression in “healthy” gastric epithelium and stroma was not encountered. Colocal-
ization studies uncovered that THBS4-positive cells are also positive for vimentin
and α-smooth muscle actin. These data signify that THBS4 is expressed and se-
creted by subpopulations of cancer-associated fibroblasts (CAFs). This was fur-
ther evidenced by in vitro experiments demonstrating that THBS4 mRNA expres-
sion is increased in CAFs of diffuse-type tumors compared to “matched” normal
gastric fibroblasts. Finally, in vitro coculture studies revealed that transcriptional
THBS4 expression in fibroblasts is stimulated and increased by diffuse-type gas-
tric tumor cells. This study is the first to describe and characterize THBS4 in the
scenario of diffuse-type gastric adenocarcinomas.
Metastatic involvement of regional lymph nodes (N+) usually accompanies diag-
nosis of gastric adenocarcinoma and is currently considered the most important
4parameter for assessment of prognosis and choice of therapy. However, estimation
of prognosis based on this parameter alone is not sufficiently reliable. In order to
identify additional molecular prognosis markers, genes whose expression corre-
lates with clinical outcome of N+ patients were extracted from the microarray data
set of this study. Via quantitative real-time PCR, several genes, including RAN
binding protein 17, homeobox C10, ras-related associated with diabetes and folate
receptor 1, were successfully validated to be prognosis-relevant. A significant
gene expression-based stratification of the N+ patients with respect to disease-free
survival was possible with these genes. Such molecular markers or signatures for
prognosis may lead the way to more accurate and personalized prognosis assess-
ment and, consequently, to more tailored therapeutic approaches in future.

Keywords: gene expression profiling, gastric adenocarcinoma, tumor
stroma, extracellular matrix, cancer-associated fibroblasts, N-stage, clinical
outcome, prognosis
























5Table of contents

Zusammenfassung............................................................................................... 2
Abstract................................................................................................................ 4
1 Introduction .................................................................................................. 14
1.1 Gastric cancer incidence and mortality ................................................... 14
1.2 Histopathology and histological classification........................................ 17
1.3 Etiology, epidemiology and carcinogenesis............................................ 21
1.4 Molecular biology ................................................................................... 22
1.5 Staging and assessment of patient prognosis .......................................... 23
1.6 Lymph node-positive patients ................................................................. 28
1.7 Objectives of this thesis........................................................................... 29
2 Material and methods .................................................................................. 31
2.1 Material ................................................................................................... 31
2.1.1 Gastric adenocarcinoma patients and tumor samples.................. 31
2.1.2 General chemicals