Identification and characterization of peptide like MHC-ligand exchange catalyst as immune response enhancer [Elektronische Ressource] / von Shashank Gupta

Shashank Gupta

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• Publié le: 01 janvier 2009
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Extrait

Identification and characterization of peptide-like MHC-
ligand exchange catalyst as immune response
enhancer

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium

(Dr. rer. nat.)

im Fach Biologie

eingereicht an der


Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I

der Humboldt-Universität zu Berlin

Von


M.Pharm, Shashank Gupta
(20.07.1978, Lucknow, India)


Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Christoph Markschies


Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Lutz-Helmut Schön



Gutachter:
Prof. Dr. Richard Lucius
Prof. Dr. Alf Hamann
PD. Dr. Christian Freund



Tag der mündlichen Prüfung: 14. 04. 2009
iContent
IDENTIFICATION  AND  CHARACTERIZATION  OF  PEPTIDE­LIKE  MHC­LIGAND 
EXCHANGE CATALYST AS IMMUNE RESPONSE ENHANCER  I 
CONTENT  II 
SUMMARY  V 
ZUSAMMENFASSUNG  VI 
1  INTRODUCTION  1 
1.1  The role of CD4+ T cells in antigen recognition and immune surveillance  1 
1.1.1  Activation of CD4+ T cells  1 
1.1.2  Signalling in T cell activation  2 
1.2  Major histocompatibility complex (MHC)  3 
1.2.1  Genome organisation of MHC proteins  3 
1.2.2  MHC class I structure and antigen processing  4 
1.2.3  MHC class II structure  5 
1.2.4  MHC class II: synthesis and antigen processing pathways  6 
1.2.4.1  Endosomal pathway  6 
1.2.4.2  Cell surface loading  7 
1.2.5  Peptide binding and stabilization  9 
1.3  Conformational transitions in MHC class II proteins  10 
1.3.1  Receptive and non‐receptive MHC conformation states  11 
1.4  Mediators of the MHC class II conformation transition  12 
1.4.1  HLA‐DM  12 
1.4.2  ‘ MHC loading enhancer’ (MLE) compounds  13 
1.5  Environmental factors and autoimmune disorders  15 
1.6  MHC linkage to various diseases  16 
1.7  Celiac disease  17 
1.7.1  Factors causing celiac disease  17 
1.7.2  Gluten antigen and HLA‐DQ mediated presentation  17 
2  OBJECTIVES  21 
3  MATERIALS AND METHODS  22 
3.1  Chemicals and Solutions  22 
3.2  Antibodies  22 
3.3  Peptides  23 
3.4  Peptide‐MLE  23 
ii 3.5  Soluble MHC class II molecules  23 
3.6  Cells  24 
3.7  Buffers  24 
3.8  Instruments  25 
3.9  Softwares  25 
3.10  Enzyme‐Linked Immunosorbant Assay (ELISA)  26 
3.11  Labelling of HLA‐DR molecules with biotin  26 
3.12  ELISpot assay  26 
3.13  Confocal laser scanning microscopy  27 
3.14  Fluorescence activated cell sorting (FACS)  27 
3.15  Cell culture  28 
3.15.1  Maintainence of antigen presenting cells (APC)  28 
3.15.2  of T cells  28 
3.15.3  Isolation and in vitro maturation of dendritic cells (DC)  28 
3.16  CTLL assay  29 
33.17  [H ] thymidine assay  29 
3.18  Peptide loading of soluble MHC molecules  29 
3.18.1  Loading of ‘empty’ HLA‐DR molecules  29 
3.18.2  Peptide loading of ‘empty’ HLA‐DQ2 molecules  30 
3.19  Ligand‐exchange of soluble HLA‐DR molecules  30 
3.20  Calculation of the ‘catalytic rate enhancement’  30 
3.21  Antigen loading of the cell surface MHC molecules  30 
3.22  T cell assays  31 
3.22.1  Pulse wash  31 
3.22.2  Permanent exposure  31 
3.23  ANS binding measurements  32 
3.24  Intrinsic tryptophan fluorescence measurements  32 
3.25  Probing with conformational specific antibodies  32 
3.26  MLE effect by conformation specific antibodies  32 
4  RESULTS  33 
4.1  Anchor side chains of short peptide fragments trigger ligand exchange of class II MHC proteins.  33 
4.1.1  Rationally designed short peptides show “MLE” activity  33 
4.1.2  Hydrogen bond forming groups enhance MLE activity  35 
4.1.3  Dipeptides show ‘drug like’ stereospecificity  36 
iii4.1.4  MLE activity always correlates with P1 anchor preferences  37 
4.1.5  Peptide‐MLE can trigger reversible ligand exchange  38 
4.1.6  Pocket‐1 of HLA‐DR1 as target for peptide‐MLE  39 
4.1.7  Summary of catalytic activity of short peptides  41 
4.1.8  Peptide‐MLE can enhance antigen loading on living antigen presenting cell (APC)  43 
4.1.9  Enhancement of antigen loading on dendritic cells  50 
4.1.10  Amplification of the antigen specific CD4+ T cell response in vitro  51 
4.1.11  of the antigen  CD4+ T cell  ex vivo  55 
4.2  Characterization of molecular mechanism behind MLE mediated ligand exchange  56 
4.2.1  Spectral analysis  56 
4.2.1.1  Monitoring of conformational shift by binding of ANS dye  56 
4.2.1.2 g of nal shift by intrinsic tryptophan fluorescence  58 
4.2.2  Detection of receptive state with conformational specific antibodies  60 
4.2.2.1  Conformational specific antibodies targeting the peptide binding site  60 
4.2.2.2 l   targeting site distant from peptide binding site  63 
4.2.2.3 l shift can be detected also in defined ligand free HLA‐DR1 preparation  64 
4.2.2.4  MEM antibodies show MLE activity  65 
4.3  Role of peptide‐MLE in celiac disease  67 
4.3.1  Structure activity relationship of dipeptides on HLA‐DQ2  67 
4.3.2  Dipeptides can catalyze loading of gluten derived antigen  69 
4.3.3  Enhanced loading of gluten derived antigen by dipeptides on APC cell surface  71 
4.3.4  Amplification of gliadin specific CD4+ T cell response by peptide‐MLE  73 
5  OUTLOOK  76 
5.1  Therapeutic potential of MLE  76 
5.2  Structural dynamics of MHC molecules  76 
5.3  MLE as putative environmental risk factor or implication on autoimmune induction  76 
6  DISCUSSION  77 
REFERENCES  84 
APPENDIX  103 
ABBREVIATIONS  103 
ACKNOWLEDGEMENTS  105 
EIDESSTATTLICHE ERKLÄERUNG  108 

iv Summary

MHC class II molecules present antigenic peptides on the cell surface for the surveillance
by CD4+ T cells. To ensure that these ligands accurately reflect the content of the
intracellular MHC loading compartment, a complex processing pathway has evolved that
delivers only stable peptide/MHC complexes to the surface.