Immunochemical and chromatographic methods for two anthropogenic markers of contamination in surface waters [Elektronische Ressource] : caffeine and coprostanol / Jos´e João Dias Carvalho. Gutachter: Ulrich Panne ; Michael G. Weller ; Rudolf J. Schneider

Jose Joao Dias Carvalho

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• Publié le: 01 janvier 2011
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• Langue: Deutsch
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Extrait

Immunochemical and Chromatographic Methods
for Two Anthropogenic Markers of Contamination
in Surface Waters: Caffeine and Coprostanol


Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Chemie
eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin
von

Apotheker José João Dias Carvalho


Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jan-Hendrik Olbertz
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Andreas Herrmann

Gutachter/innen:
1. Prof. Dr. Ulrich Panne
2. Priv.-Doz. Dr. Michael G. Weller
3. Priv.-Doz. Dr. Rudolf J. Schneider

Tag der mündlichen Prüfung: 12.04.2011


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2 Die vorliegende Arbeit wurde im Zeitraum von Oktober 2006 bis März 2010 im
Arbeitskreis von Prof. Dr. Ulrich Panne, Institut für Chemie, Humboldt-Universität zu
Berlin durchgeführt.

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Dedicated to my great-uncle José Fernando Coelho de Sousa,
whom I never met.
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Zusammenfassung
Koffein (1,3,7-Trimethylxanthin) und Coprostanol (5β-cholestan-3β-ol) wurden im
Berliner Oberflächenwasser nachgewiesen. Ihre Konzentrationen korrelierten mit
dem Verunreinigungsgrad der Proben, was nahelegt, dass sie sich als Marker für
menschliche Aktivität eignen. Bemerkenswerterweise wurde Koffein in jeder
einzelnen Oberflächenwasserprobe oberhalb der Bestimmungsgrenze von 0,025
µg/L gefunden.
Um Oberflächenwasserproben in größeren Serien zu untersuchen, war die
Entwicklung zweier neuer Methoden erforderlich: ein Immunoassay, basierend auf
einem monoklonalen Antikörper für Koffein und eine dispersive flüssig-flüssig
Mikroextraktionsmethode (DLLME), gefolgt von Flüssigkeitschromatographie
gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) für Coprostanol.
Der entwickelte Koffein-Immunoassay zeigt die beste je erhaltene Nachweisgrenze
für Koffein (0,001 µg/L), erlaubt Hochdurchsatz-Analysen und erfordert keine
Probenvorbereitung. Der Assay wurde auch erfolgreich für die Messung von Koffein
in Getränken, Haarwaschmitteln, Koffeintabletten und menschlichem Speichel
angewendet.
Antikörper gegen Coprostanol sind nicht kommerziell erhältlich. Eine neue Strategie
Anti-Coprostanol-Antikörper zu generieren wurde erarbeitet, die eine analoge
Verbindung – Isolithocholsäure (ILA) – als Hapten verwendet, mit der eine Gruppe
von Mäusen immunisiert wurde. Ein polyklonales Anti-ILA-Serum wurde produziert,
welches Coprostanol bindet, aber die niedrige Affinität erlaubte nicht den Aufbau
eines Immunoassays, der die Messung von Umweltkonzentrationen des Anayten
(im Bereich ng/L) zulässt. Spezifische Anti-ILA-Immunglobuline G wurden auch in
den Faeces der Mäuse gefunden.
Coprostanol wurde in den Wasserproben durch die Verwendung einer
neuentwickelten LC-MS/MS-Methode unter APCI-Ionisation (atmospheric pressure
chemical ionisation) gemessen. Konzentrationen oberhalb von 0,1 µg/L wurden
nach Voranreicherung der Probe mittels DLLME bestimmt. Diese
Extraktionsmethode erwies sich auch als geeignet für die Anreicherung von
Coprostanol-ähnlichen Verbindungen wie Cholesterol, Cholestanol, Cholestanon,
Ergosterol und Stigmasterol.
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Abstract
Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) and coprostanol (5β-cholestan-3β-ol) were
detected in samples of Berlin’s surface water. Their concentrations correlated with
the contamination status of the samples, suggesting their usefulness as markers of
human activity. Remarkably, caffeine concentrations were always well above the
limit of quantitation of 0.025 µg/L.
In order to screen surface water samples in larger series, the development of two
novel methods was required: a monoclonal antibody-based immunoassay for
caffeine and a dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) method, followed by
liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for coprostanol.
The caffeine immunoassay developed shows the best analytical limit of detection
(LOD) obtained so far for caffeine (0.001 µg/L), allows high-throughput analysis,
and does not require sample pre-treatment. The assay was also successfully
employed to measure caffeine in beverages, shampoos, caffeine tab-lets, and
human saliva.
Antibodies to coprostanol are not commercially available. A new strategy to
generate anti-coprostanol antibodies was elaborated using an analogous com-
pound as hapten – isolithocholic acid (ILA) – and immunizing a group of mice. A
polyclonal anti-ILA serum was produced, which binds coprostanol but the low
affinity did not permit setting up an immunoassay to measure environmental
concentrations of the analyte (in the range of ng/L).
Specific anti-ILA immunoglobulin G were also found in the faeces of the immunized
mice.
Coprostanol was quantified in the water samples using a newly developed LC-
MS/MS method using atmospheric pressure chemical ionisation (APCI).
Concentrations above 0.1 µg/L were determined after sample preconcentration
using DLLME. This extraction method also proved to be successful for enrichment
of coprostanol-related compounds such as cholesterol, cholestanol, cholestanone,
ergosterol, and stigmasterol.


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