Influence of ABCA1 and ABCA7 on the lipid microenvironment of the plasma membrane [Elektronische Ressource] / von Anna Pia Plazzo

Anna Bosch

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• Publié le: 01 janvier 2009
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• Langue: Deutsch
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Extrait

I
Influence of ABCA1 and ABCA7 on the
lipid microenvironment of the plasma membrane

Dissertation



zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie


eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Dottore Magistrale in Biotecnologie Industriali
Anna Pia Plazzo
geb. 17.10.1981 in San Giovanni Rotondo, Italien


Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Dr. h.c. Christoph Markschies

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Lutz-Helmut Schön
Gutachter: 1. Prof. Dr. Andreas Herrmann
2. Prof. Dr. Thomas Günther-Pomorski
3. Prof. Dr. Thomas Eitinger

Tag der mündlichen Prüfung: 12.06.2009 II























Alla mia famiglia III
Zusammenfassung
Der ABC-Transporter ABCA1 ist unmittelbar in die zelluläre Lipidhomeostasie einbezogen, in dem
er die Freisetzung von Cholesterol an plasmatische Rezeptoren, wie ApoA-I, vermittelt. Trotz
intensiver Untersuchungen ist dieser molekulare Mechanismus nicht verstanden. Verschiedene
Studien deuten daraufhin, dass durch die Aktivität von ABCA1 bedingte Veränderungen in der
Lipidphase der äußeren Hälfte der Plasmamembran (PM) wichtig für die Freisetzung des
Cholesterols sind.
In der vorliegenden Arbeit wird die Lipidumgebung von ABCA1 in der PM lebender Säugetierzellen
unter Anwendung der Fluoreszenzlebenszeitmikroskopie von fluoreszierenden Lipidsonden
untersucht. Es wurde eine breite Verteilung der Fluoreszenzlebenszeiten der Sonden gefunden, die
sensitiv gegenüber Veränderungen der lateralen und transversalen Organisation der Lipide ist. Im
Einklang mit Studien an riesengroßen unilamellaren Vesikeln und Plasmamembranvesikeln weisen
unsere Ergebnisse die Existenz einer größeren Vielfalt submikroskopischer Lipiddomänen auf.
Die FLIM-Untersuchungen an ABCA1 exprimierenden HeLa-Zellen weisen eine die Lipidphase
destabilisierende Funktion des Transportes aus. Dieses wurde unterstützt durch die Lipidanalyse von
Fraktionen der PM. Auf der Basis unserer Untersuchungen und früheren Daten stellen wir die
Hypothese auf, dass die Exponierung von Phosphatidylserin (PS) auf der Zelloberfläche ein
zentrales Ereignis der ABCA1 bedingten Veränderungen ist. Allerdings zeigen vergleichende Studien
an ABCA7 exprimierenden Zellen, dass dies nicht ausreicht, um die ABCA1 verursachten
Veränderungen in der Lipidpackung der PM zu erklären.
Unsere Ergebnisse beweisen, dass die Fähigkeit von ABCA1, den Cholesterolefflux zu vermitteln,
auf durch den Transporter bedingte Veränderungen in der LP der PM zurückzuführen sind, die
unabhängig von der Bindung von ApoA-1 sind und dieser vorausgehen. Diese Veränderungen sind
notwendig für die Lipidierung von ApoA-1 und der Generierung von HDL-Partikeln.
Schlagwörter: ABCA1, Plasmamembran, Cholesterol, Lipiddomänen, FLIM


IV
Abstract
The ABCA1 transporter organizes cellular lipid homeostasis by promoting the release of cholesterol
to plasmatic acceptors such as ApoA-I. Despite intensive investigation, the molecular mechanism of
such a process has not yet been clarified.
In the present study we report on the analysis of the ABCA1 lipid microenvironment at the plasma
membrane of living cells, by a novel approach based on fluorescence lifetime imaging microscopy
(FLIM). In the plasma membrane of mammalian cells, a broad fluorescence lifetime distribution
sensitive to treatments interfering with the membrane lateral and transbilayer organization was
found. In agreement with investigations in giant unilamellar vesicles and giant plasma membrane
vesicles, our results are consistent with the existence of a large variety of submicroscopic lipid
domains.
Based on that, FLIM in HeLa cells expressing ABCA1 revealed the destabilizing function of the
transporter on the lipid arrangement at the membrane, indicating that lipid packing was a primary
target of ABCA1 activity. This was corroborated by the analysis of plasma membrane fractions
isolated by density fractionation. On the basis of our analysis and previous data, we speculate that
the exposure of phosphatidylserine on the cell surface is a central event for ABCA1-dependent
modifications. However, a comparative study of cells expressing ABCA7, the member of the ABCA
subfamily with the highest homology to ABCA1, revealed that exposure of PS alone cannot account
for the detected effects.
Collectively, our data suggest that the ability of ABCA1 to promote cholesterol efflux is independent
and precedes its actual binding to ApoA-I. Rather, ABCA1-induced plasma membrane modifications
are necessary for the lipidation of ApoA-I and the generation of high density lipoprotein particles.

Key Words: ABCA1, plasma membrane, cholesterol, lipid domain, fluorescence lifetime imaging




V
List of abbreviations
ABC ATP binding cassette Lo Liquid ordered
ACAT Acyl-CoA cholesteryl acyl transferase LXR Liver X receptor
MALDI- Matrix assisted laser desorption
ADP Adenosine diphosphate
TOF ionization-time of flight
ALD Adrenoleukodystrophy M βCD Methyl- β-cyclodextrin
Apo Apolipoprotein MDR Multi drug resistance
2+ATP Adenosine triphosphate Mg Magnesium
BSA Bovine serum albumine MLV Multilamellar vesicle
BSEP Bile salt efflux pump MRP Multi drug resistance protein
2+Ca Calcium MS Mass spectrometry
[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-
cAMP Cyclic adenosine monophosphate NBD 4-yl)amino]
CE Cholesterol esters NBF Nucleotide binding fold
Cer Ceramide PA Phosphatidic acid
Cystic fibrosis transmembrane
CFTR PC Phosphatidylcholine
conductance regulator
CHO Chinese hamster ovary Pgp P glycoprotein
CNX Calnexin PKA, C Protein kinase A, C
ConA Concanavalin A PL Phospholipids
CVD Cardiovascular disease PM Plasma membrane
DHB 2,5-dihydroxybenzoic acid PO Palmitoyl-oleoyl
Peroxisome proliferator-activated
DO Di-oleoyl PPAR receptor
DP Di-palmitoyl PS Phosphatidylserine
DRM Detergent resistant membranes PSM N-palmitoyl-D-sphingomyelin
ER Endoplasmic reticulum RCT Reverse cholesterol transport
FL Flotillin Rho Rhodamine
Fluorescence lifetime imaging
FLIM RXR Retinoid X receptor
microscopy
Fluorescence recovery after FRAP SD Standard deviation
photobleaching
FRET Förster resonance energy transfer SEM Standard error of the mean
GP Generalized polarization SM Sphingomyelin
GPMV Giant plasma membrane vesicle SMase Sphingomyelinase
GPI Glycosylphosphatidylinositol SSM N-stearoyl-D-sphingomyelin
Transporter associated with
GUV Giant unilamellar vesicle TAP
antigen processing
HDL High density lipoprotein TCR T cell receptor
HEK Human embryonic kidney TD Tangier disease
IDL Intermediate density lipoprotein TfR Transferrin receptor
LacCer Lactosyl ceramide TMD Transmembrane domain
Ld Liquid disordered VLDL Very low density lipoprotein
LDL Low density lipoprotein WHAM Wisconsin hypoalpha mutant VI
Index
Zusammenfassung .............................................................................................................. III
Abstract ................................................................................................................................IV
List of abbreviations............................................................................................................. V
1 Introduction ...............................................................................................1
1.1 The plasma membrane .................................................................................................1
1.1.1 The repertoire of membrane lipids..................................................................................... 1
1.1.2 Phase separation in model membranes .............................................................................. 3
1.1.3 Lipid rafts in the plasma membrane................................................................................... 5
1.1.4 Lipid asymmetry and protein-mediated lipid translocation ............................................... 6
1.2 ATP-Binding Cassette (ABC) transporters ................................................................8
1.2.1 General features ................................................................................................................. 8
1.2.2 Domain organization and transport cycle........................................................................... 9
1.2.3 ABC transporters and the transport of lipids.................................................................... 10
1.2.4 The ABCA subfamily....................................................................................................... 12
1.2.4.1 ABCA1: the key controller of cholesterol efflux........................................................................14