Influence of HCMV proteins pUL71 and pUL77 on viral maturation [Elektronische Ressource] / Christina Sylvia Meissner. Gutachter: Elke Bogner ; Martin Messerle ; Thorsten Wolff

Christina Sylvia Meissner

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• Biologie

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• Publié par: humboldt-universitat_zu_berlin
• Publié le: 01 janvier 2011
• Nombre de lectures: 42
• Langue: Deutsch
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Extrait

Humboldt Universität zu Berlin
DISSERTATION
Influence of HCMV proteins pUL71 and
pUL77 on viral maturation

zur Erlangung des akademischen Grades
d o c t o r r e r u m n a t u r a l i u m (Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin
von
Mag. rer. nat. Christina Sylvia Meissner


Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jan-Hendrik Olbertz
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Andreas Herrmann
Gutachter: 1. Prof. Dr. Elke Bogner
2. Prof. Dr. Martin Messerle
3. PD Dr. Thorsten Wolff

eingereicht: 27.06.2011
Datum der Promotion: 14.11.2011 2 Zusammenfassung
Die Bildung infektiöser Viruspartikel des humanen Zytomegalievirus ( HCMV) ist ein
mehrstufiger Prozess. Sie beginnt mit der Verpackung der DNA in die Kapside im Kern,
gefolgt von weiterer Reifung während des Transports durch das Zytoplasma und der
abschließenden Freisetzung aus der Zelle. Im Zuge dieser Arbeit wurden zwei Proteine, die
Einfluss auf die ebengenannten Prozesse haben, analysiert.
Der erste Teil der Arbeit befasst sich mit der funktionellen Charakterisierung des HCMV
Proteins pUL77. Es ist bekannt, dass das homologe Protein pUL25 in -Herpesvirinae
essentiell für die DNA-Verpackung ist. Zunächst konnte das Protein als Kapsid-assoziiertes
strukturelles Protein identifiziert werden. Es wurden Interaktionen von pUL77 mit DNA-
Verpackungs- und Kapsidproteinen gezeigt. Weiterhin wurde die DNA-Bindungsfähigkeit von
pUL77 in verschiedenen „in vitro“-Experimenten untersucht. Zusammengefasst weisen
unsere Ergebnisse auf eine Funktion von HCMV pUL77 bei der DNA-Verpackung hin.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde das HCMV Protein pUL71 charakterisiert, das in allen
Herpesviren konserviert vorkommt, dessen Funktion jedoch nicht charakterisiert ist. Zunächst
wurde das Protein als strukturelles Tegumentprotein mit “early-late“ Expressionskinetik
klassifiziert. Weiterhin wurden die subzelluläre Lokalisation sowie virale und zelluläre
Interaktionspartner untersucht. Die Ergebnisse weisen auf eine Funktion von HCMV pUL71
bei der Reifung und beim Transport der Virionen im Zytoplasma hin. „In silico“-Vorhersagen
zeigten ein „Leuzin Zipper“-Motiv in pUL71, das als mögliche Oligomerisationsdomäne
dienen könnte. Mutationen wurden in dieses Motiv eingebracht und die resultierenden
Proteine auf ihre Oligomerisationsfähigkeit mit „in vitro“-Methoden und in rekombinanten
Viren untersucht. Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass das „Leuzin Zipper“-Motiv
wichtig für die Funktion von pUL71 ist und diese mit einer unbeeinträchtigten
Oligomerisation des Proteins zusammen hängt.

Schlagwörter:
Humanes Zytomegalievirus, DNA Verpackung, Transport und Reifung von
Viruspartikel, Oligomerisierung

3 Abstract
The morphogenesis of Human cytomegalovirus ( HCMV) virions starts with the capsid
assembly and DNA insertion in the nucleus followed by maturation during transport through
the cytoplasm prior to release of virus progeny. In this study we are functionally
characterising two proteins that are involved in those steps.
The function of essential HCMV protein pUL77 is characterised in the first part of the study.
HCMV pUL77 was shown to be a structural protein associated with capsids. Furthermore, our
experiments demonstrated that HCMV pUL77 interacts with DNA packaging motor
components and capsid proteins. The ability of HCMV pUL77 to bind double-stranded DNA
was studied in “in vitro” assays designed for this study. The homologue α-Herpesvirinae
protein pUL25 is described to be involved in processes connected with DNA packaging. Data
obtained in this study demonstrates that HCMV pUL77 might serve a similar function.
In the second part of the study HCMV pUL71, conserved throughout the Herpesvirus family
but to date unclassified, was functionally characterised. HCMV pUL71 was defined a
structural tegument protein with early-late expression kinetics. We studied the sub-cellular
localisation and interactions of pUL71 with a subset of cellular and viral proteins. Thereby we
could show that HCMV pUL71 function might be connected with processes of viral egress.
By in silico analyses we identified a leucine zipper motif in pUL71 that might serve as a
putative oligomerisation domain. In order to investigate the function of the leucine zipper
motif, we performed in vitro assays and investigated the alterations of the motif in the viral
context. Taken together we can conclude that (i) an intact leucine zipper motif is crucial for
the function of pUL71 and (ii) this function is dependent upon undisturbed oligomerisation of
the protein.

Keywords:
Human cytomegalovirus, DNA packaging, egress, oligomerisation
4 Table of content
Zusammenfassung 3
Abstract 4
Table of content 5
Introduction 9
1.1 HCMV and the Herpesviridae 9
1.1.1 The viral particles 10
1.1.2 The viral genome 12
1.2 From structural components to infectious particles 12
1.2.1 Attachment and virus entry 13
1.2.2 Gene expression and replication 14
1.2.3 Capsid assembly and DNA packaging 14
1.2.4 Maturation and egress 15
1.3 Aim of the study 16
2 Materials and Methods 18
2.1 Materials 18
2.1.1 Chemicals, consumables and equipment 18
2.1.2 Enzymes, Markers and Kits 26
2.1.3 Bacteria, cells and virus 28
2.1.4 Buffers and media 29
2.1.5 Plasmids 32
2.1.6 Primers 35
2.1.7 Used antibodies 37
2.2 Methods 40
2.2.1 Cultivation of bacteria (E. coli methods) 40
2.2.2 of yeast cells 41
2.2.3 Cultivation of insect cells 42
2.2.4 of mammalian cells 42
2.2.5 Cloning strategies and molecular biological methods 45
2.2.6 Protein methods 51
5 2.2.7 Immunological Methods 54
2.2.8 Protein interaction studies 56
2.2.9 Electron microscopy (EM) 60
2.2.10 In silico tools 60
3 Results 61
3.1 Functional characterisation of HCMV pUL77 61
3.1.1 Identification of the protein pUL77 61
3.1.2 Association of pUL77 with capsids 63
3.1.3 Interaction of HCMV pUL77 with DNA packaging proteins 64
3.1.4 DNA binding of HCMV pUL77 66
3.1.5 HCMV pUL77 binds to dsDNA of at least 500bp in length 68
3.2 Functional characterisation of HCMV pUL71 72
3.2.1 Identification of the protein pUL71 72
3.2.2 Association of pUL71 with tegument fraction 74
3.2.3 Expression of pUL71 within the viral life cycle 75
3.2.4 pUL71 and the assembly complex (AC) 78
3.2.5 Screening pUL71 against a cellular library 79
3.2.6 Screening pUL71 against a viral library 80
3.2.7 Confirming interactions found in the Y2H screen 81
3.2.8 Oligomerisation of pUL71 83
3.2.9 The leucine zipper motif 85
3.2.10 Analysis of the leucine zipper-like motif in vitro 91
3.2.11 The leucine zipper motif is associated with pUL71 function 95
4 Discussion 103
4.1 Functional characterisation of HCMV pUL77 103
4.2 HCMV pUL71 106
5 Literature 115
Anhang 132
Abbreviations 132
Herpes gene products and proteins (239) 135
6 Amino acids 137
In silico analysis HSV-1 UL51 in comparison to HCMV UL71 138
Danksagung 139
Eidesstattliche Erklärung 142

7 8 1 Introduction
1.1 HCMV and the Herpesviridae
The human cytomegalovirus (HCMV) is taxonomically classified in the family of
Herpesviridae according to the international committee on virus taxonomy (=ICTV) (194).
Characteristics Herpesviridae comprise are (i) structural similarities like composition of the
virus particle (1.1.1.) as well as (ii) encoding their own viral DNA-polymerase and (iii)
establishment of a life-long persistence in their host. (2)
Taking biologic properties such as host range and growth kinetics into account the
Herpesviridae can be subclassified into three subfamilies: -, β- and γ-Herpesvirinae.
- Herpesvirinae are characterised by common features like broad host range, a
comparatively short replication cycle (<1 day) and fast cell-to-cell spread. Persistence takes
place in sensory neurons. Members of this subfamily causing pathogenicity in humans are
herpes simplex virus type 1 and 2 (HSV-1, HSV-2) as well as varizella zoster virus (VZV) (2,
194).
β- Herpesvirinae are characterised by a narrow host range, comparatively long replication
cycles (>1 day) and slow cell-to-cell spread. Persistence takes place in lymphotropic organs,
secretory glands and renal tissue. Human pathogenic members of this subfamily are HCMV,
human herpes virus type 6 (HHV-6) and human herpes virus type 7 (HHV-7) (2, 194).
γ- Herpesvirinae are characterised by a strict host range and even restricted towards B- and T-
cells. Furthermore they are convincingly linked to oncogenesis. Human pathogenic members
of this subfamily are Epstein-Barr virus (EBV) and human herpes virus type 8 (HHV-8) (2,
194).
HCMV infection of host cells is characterised by a strong cytopathic effect causing
enlargement of the cells, eponymously called cytomegaly. Considering the characteristics for
β-Herpesvirinae mentioned above HCMV can infect a remarkabl