Inhibition of HBV replication by RIG-I stimulation with 5`-triphosphated siRNA in vitro and in vivo [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Gregor Ebert

Gregor Ebert

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• Publié le: 01 janvier 2009
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Extrait

Inhibition of HBV replication by
RIG-I stimulation with 5`-triphosphated siRNA
in vitro and in vivo

 
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades
der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Universität zu Köln
 
 
                                                                                                           
 
 
 
vorgelegt von
Gregor Ebert
aus Buchen

Köln, September 2009























Berichterstatter: Prof. Dr. Thomas Langer
Prof. Dr. Martin Krönke

Prüfungsvorsitzender: Prof. Dr. Ansgar Büschges

Tag der Disputation: 27. Oktober 2009 Abstract
For a proportion of patients, HBV infection results in chronic disease with severe
consequences like liver cirrhosis or hepatocellular carcinoma. Approved therapies of
chronic hepatitis B include administration of antivirally active IFN-α and inhibitors of
viral reverse transcription. These drugs control replication, but HBV cccDNA, the
episomal transcription template, persists in most cases. Hence, lifelong therapy is
required, accompanied by severe side effects and development of drug resistant
mutants. An alternative and probably safe immunotherapeutic approach for clearance
of HBV may be achieved by the stimulation of pattern-recognition receptors inducing
an endogenous type-I IFN response. In this study the cytosolic helicase RIG-I was
triggered by in vitro transcribed 5’-triphosphated (3p-) dsRNA. Stimulation induced an
RIG-dependent antiviral type-I IFN response and controlled HBV replication in vitro in
stable HBV replicating cell lines as well as in HBV infected primary human
hepatocytes. In vivo, virus replication in HBV transgenic animals was transiently
controlled when Rig I ligands were complexed and i.v. injected.
To enhance and prolong the antiviral effect, siRNAs targeting overlapping open
reading frames of the HBV genome at the 3´-end of multiple HBV-RNAs were
designed and investigated whether they can be in vitro transcribed and act as RIG-I
ligands, and thus combine the immune stimulatory potential with HBV specific gene
silencing. 3p-siRNAs were transfected into HBV replicating cells, induced INF-I and
IFN-stimulated genes. HBV replication markers were significantly reduced and the
antiviral effect of 3p-siRNA was superior to siRNA or 3p-RNA alone. Stronger effects
of 3p-siRNAs on HBV replication were confirmed in HBV infected primary human
hepatocytes, as well as in vivo. Nevertheless, the gene silencing effect of 3p-siRNA
seemed to be limited in the mouse model due to insufficient targeting of hepatocytes,
the HBV host cells. Application of cholesterol coupled siRNA improved hepatocyte
specific targeting. Furthermore, we showed that 3p-siRNA besides a direct antiviral
+effect additionally induced infiltration of cytotoxic CD8 T cells to the liver, potentially
leading to elimination of infected hepatocytes.
The results of this study demonstrate that HBV-specific 5`-triphosphated siRNAs
efficiently block HBV replication in vitro and in vivo. Combination of endogenous
type-I IFN induction by stimulation of RIG-I with HBV sequence-specific gene
silencing by RNAi in one single molecule could be a promising alternative to the
actual standard therapeutic approaches against chronic HBV infection.

  I  Zusammenfassung
Eine Infektion mit dem Hepatitis B Virus führt bei einem Teil der Patienten zu einem
chronischen Infektionsverlauf mit schwerwiegenden Spätfolgen, wie Leberzirrhose
oder hepatozellulärem Karzinom. Die gängigen Therapien einer chronischen HBV
Infektion umfassen IFN-α und Reverse Transkriptase Inhibitoren als Hemmstoff der
viralen Replikation. Diese Medikamente kontrollieren die Virusreplikation. In d en
meisten Fällen ist es aber nicht möglich, die episomal persistierende virale
Transkriptionsmatrize (HBV cccDNA) zu eliminieren. Dadurch wird eine lebenslange
Therapie erforderlich, die von Nebenwirkungen und dem Entstehen von
arzneimittelresistenten HBV-Mutationen begleitet sein kann. Die Stimulation von
RIG-I, einer cytoplasmatischen Helikase, kann zu der Freisetzung von endogenem,
antiviral wirksamen Typ 1 IFN führen und stellt somit einen neuen, therapeutischen
Ansatz für eine Behandlung der chronischen Hepatitis B dar. Die Stimulation von
RIG-I mittels durch in vitro Transkription generierte 5´-triphosphorylierte (3p),
doppelsträngige RNA führte in stabil HBV exprimierenden Zelllinien, in HBV
infizierten primären humanen Hepathozyten und in HBV transgenen Mäusen zu einer
Ausschüttung von Typ 1 IFN, und folglich zu einer Suppression der Virusreplikation.
Um diesen antiviralen Effekt zu verstärken, wurden siRNAs entworfen, die die
überlappenden offenen Leseraster des HBV Genoms am 3`-Ende aller viralen RNAs
als Ziel haben. Es wurde untersucht, ob diese nach in vitro Transkription zur
Stimulation von RIG-I fähig sind und es somit zu einer Kombination von
Immunstimulation und Hemmung der viralen Genexpression kommt. Die
ausgewählten 3p-siRNAs führten in HBV replizierenden Zellen zur Induktion von Typ
1 IFN und IFN-stimulierter Gene. Sie kontrollierten die HBV Replikation sowohl in
stabil HBV exprimierenden Zelen, in HBV infizierten primären Hepathozyten, als
auch in HBV transgenen Mäusen effizienter als die alleinige Applikation von siRNA
oder 3p-RNA. Im Mausmodel konnte außerdem durch die Kopplung von siRNA an
Cholesterol ein verbessertes Targeting von Hepatozyten, den HBV-Wirtszellen,
erreicht werden. Die Injektion von 3p-siRNAs führte in vivo zu Einwanderung von
+zytotoxischen CD8 T-Zellen in die Leber, die zur Elimination der HBV infizierten
Zellen beitragen können. Somit kann durch HBV-spezifische 3p-siRNA die HBV
Replikation in vitro und in vivo effektiv unterdrückt werden. Vereinigt in einer
Substanz stellt die kombinierte Induktion von endogenem Typ 1 IFN und die
spezifische Hemmung der viralen Genexpression eine vielversprechende Alternative
zu den Therapien der chronischen HBV-Infektion dar.
  II  Table of contents  
 
Table of contents

Abstract..................................................................................................................................................... I
Zusammenfassung.................................................................................................................................. II
Table of content......................... III
Table of figure...................................................................................................................................... VIII

1 Introduction.............................................................................................................. 1
1.1 The Immune System........................................................................................................................ 1
1.1.1 Adaptive immunity.......................................................................................................................... 2
1.1.2 Innate immunity.............................................................................................................................. 5
1.1.3 Pathogen-associated molecular patterns: PAMPs......................................................................... 7
1.1.4 Pattern-recognition receptors: PRR............................................................................................... 7
1.2 Cytosolic helicase RIG-I............................................................................................................... 10
1.2.1 Structure of RIG-I, the retinoic acid inducible gene-I...... 10
1.2.2 RIG-I activation............................................................................................................................ 11
1.2.3 RIG-I signaling........................................................................................... 14
1.3 Interferon class I........................................................................................................................... 17
1.3.1 The interferon type-I system........................................................................................................ 17
1.4 Hepatitis B virus................................................................................. 18
1.4.1 Classification.............................................................................................. 18
1.4.2 HBV history and research............................................................................................................ 19
1.4.3 Liver structure............................................................................................. 20
1.4.4 Epidemiology of HBV infe