Isomer specific effects of conjugated linoleic acid on macrophage ABCG1 expression [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Josef Ecker

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• Publié par: universitat_regensburg
• Publié le: 01 janvier 2008
• Nombre de lectures: 20
• Langue: Deutsch
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Extrait

Isomer specific effects of Conjugated Linoleic
Acid on macrophage ABCG1 expression




Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der
Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) der Naturwissenschaftlichen
Fakultät III – Biologie und vorklinische Medizin der
Universität Regensburg






vorgelegt von
Josef Ecker
aus Regensburg
Oktober 2007 Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von Juni 2005 bis Oktober 2007 am
Institut für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin des Klinikums der
Universität Regensburg unter der Anleitung von PD Dr. Thomas Langmann.













Promotionsgesuch eingereicht am: 17.10.2007


Prüfungsausschuss:
Vorsitzender:
1. Gutachter: PD Dr. Thomas Langmann
2. Gutachter: Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer
3. Gutachter: Prof. Dr. Stefan Schneuwly Danksagung:
Mein besonderer Dank gilt Herrn PD Dr. Thomas Langmann für die Betreuung
dieser Arbeit. Seine Anleitung, sowie kritische und konstruktive
Diskussionsbereitschaft hat wesentlich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen.

Herrn Prof. Dr. Gerd Schmitz danke ich vielmals für die Ermöglichung dieser
Arbeit an seinem Institut, für die großzügige wissenschaftliche Unterstützung
und für die Ermöglichung zahlreicher Kongreßbesuche.

Herrn Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer danke ich für die Bereitschaft zweiter
Gutachter dieser Arbeit zu sein.

Ein herzliches Dankeschön auch an Dr. Christoph Möhle und Dr. Gerhard
Liebisch, die mich bei der Auswertung und Durchführung der Microarrays bzw.
der ESI-MS/MS Versuche wesentlich unterstützten und auch für sonstige
Fragen ständig erreichbar waren.

Weiterhin möchte ich mich ausdrücklich bei Manfred Haas für etliche
Labortätigkeiten und für die nette Laboratmosphäre bedanken.

Meinen weiteren Laborkollegen Barbara, Bettina und Wolfgang, sowie allen
anderen Mitarbeitern des Institutes für Klinische Chemie danke ich für das sehr
angenehme Arbeitsklima und für die stets gute Zusammenarbeit.

Schließlich möchte ich mich noch herzlich bei Dr. Marion Schuierer für die
Vermittlung dieser Doktorandenstelle und etliche hilfreiche Konversationen
bedanken. Table of Contents


1 Introduction ................................................................................................. 7
1.1 Conjugated linoleic acid (CLA)............................................................. 7
1.2 ATP-binding cassette transporter G1 (ABCG1) ................................. 11
1.3 Sterol regulatory element binding protein (SREBP)........................... 14
1.4 Liver X receptor (LXR) ....................................................................... 20
2 Aims.......................................................................................................... 25
3 Materials and Methods.............................................................................. 26
3.1 Materials ............................................................................................ 26
3.1.1 Technical equipment................................................................... 26
3.1.2 Consumables 27
3.1.3 Reagents .................................................................................... 27
3.1.4 Gene Expression Assays............................................................ 28
3.1.5 Enzymes, inhibitors and kits for molecular biology ..................... 28
3.1.6 Cells 29
3.1.7 Plasmids ..................................................................................... 29
3.2 Methods............................................................................................. 30
3.2.1 Working with cells....................................................................... 30
3.2.1.1 Cell culture and stimulation.................................................. 30
3.2.1.2 Transfections and reporter gene assays ............................. 31
3.2.2 Working with DNA 31
3.2.2.1 Isolating and purifying DNA ................................................. 31
3.2.2.2 Analyzing DNA .................................................................... 31
3.2.2.3 Amplification of DNA............................................................ 32
3.2.2.4 Cloning of DNA 32 3.2.2.5 Sequencing of DNA ............................................................. 32
3.2.3 Working with RNA....................................................................... 33
3.2.3.1 Isolation and analysis of RNA.............................................. 33
3.2.3.2 Reverse transcription of RNA 33
3.2.3.3 Real-time quantitative RT-PCR (TaqMan™) analysis ......... 33
3.2.3.4 DNA-Microarray analysis..................................................... 35
3.2.4 Working with proteins ................................................................. 36
3.2.4.1 Isolation and quantification of proteins ................................ 36
3.2.4.2 Western blot analysis .......................................................... 36
3.2.4.3 Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) ........................ 36
3.2.5 Cholesterol efflux assays............................................................ 37
3.2.6 Statistical analysis ...................................................................... 38
4 Results...................................................................................................... 39
4.1 Gene expression analysis of t9,t11-CLA treated primary human
monocytes derived macrophages with DNA-microarrays ............................. 39
4.2 Verification and further analysis of the candidate genes in primary
human monocyte derived macrophages and the myeloid cell line THP-1 .... 41
4.3 Analysis of SREBP-1c and ABCG1 protein expression in t9,t11-CLA
treated human macrophages........................................................................ 43
4.4 Analyis of t9,t11-CLA mediated activation of ABCG1 ........................ 44
4.5 Analyis of t9,t11-CLA mediated activation of SREBP-1c ................... 50
4.6 Concentration range of t9,t11-CLA .................................................... 52
4.7 Effects of t9,t11-CLA on ABCA1 and ABCG1 mediated cholesterol
efflux ……………………………………………………………………………………………….54
4.8 Summary of the results...................................................................... 55
5 Discussion................................................................................................. 56
5.1 Isomer specific effects of CLA on macrophage gene transcription .... 56 5.2 T9,t11-CLA mediated activation of ABCG1........................................ 58
5.3 T9,t11-CLA mediated activation of SREBP-1c................................... 60
5.4 Effects of CLA isomers on lipid metabolism....................................... 62
6 Conclusion ................................................................................................ 66
7 References 68
8 Publications............................................................................................... 80
9 Figures...................................................................................................... 81
10 Tables.................................................................................................... 84
11 Abbreviations......................................................................................... 85
12 Eidesstattliche Erklärung....................................................................... 87 Introduction
1 Introduction
1.1 Conjugated linoleic acid (CLA)
Conjugated linoleic acid (CLA) is a collective term for a group of positional
and geometrical isomers of linoleic acid with a conjugated double bond system.
It is formed in the digestive tracts of ruminant animals such as cows, sheep and
goats by fermentative bacteria. Butyrivibrio fibrisolvens is a fermentative
anaerobic bacterium that isomerizes cis-9,trans-12-octadecenoic acid (linoleic
acid) to cis-9,trans-11-octadecenoic acid (cis-9,trans-11-CLA), followed by the
hydrogenation of the cis-double bond of the conjugated diene to yield trans-11-
octadecenoic acid (trans-vaccenic acid) (figure 1). Trans-vaccenic acid is further
converted to cis-9,trans-11-CLA within mammalian cells through stearoyl-CoA
desaturase (SCD), a δ -9 desaturase [1]. In addition to rumenal bacteria, enteric
bacteria such as Bifidobacterium species and Lactobacillus species can
produce various CLA isomers from linoleic acid [2]. The most common sources
of CLA are beef, dairy products and partly hydrogenated vegetable oils [3]. The
daily intake of CLA has been calculated for various countries and estimated at
several hundred mg/day in a typical diet [4]. The cis-9,trans-11 (c9,t11)- and
trans-10,cis-12 (t10,c12)-CLA isomers are the major dietary forms of CLA, but
lower levels of other isomers such as trans-9,trans-11 (t9,t11)-CLA are also
present in CLA food sources (figure 2) [5].
- 7 - Introduction

Figure 1: Formation of c9,t11-CLA in the digestive trac