Molecular analyses of the pathogenic interaction formed between the model legume Medicago truncatula and the oomycete Aphanomyces euteiches [Elektronische Ressource] / von Oyunbileg Nyamsuren

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• Publié le: 01 janvier 2004
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Extrait

Molecular Analyses of the Pathogenic
Interaction Formed Between the Model Legume
Medicago truncatula and the Oomycete
Aphanomyces euteiches
Dem Fachbereich Biologie der Universität Hannover
zur Erlangung des Grades
Doktorin der Naturwissenschaften
Dr. rer. nat.
genehmigte Dissertation
von
Oyunbileg Nyamsuren
geboren am 08.03.1976
in Süd-Gobi aimag, Mongolei
2004Referent : Prof. Dr. Hans-Jörg Jacobsen
Korreferent : PD Dr. Philipp Franken
Tag der Promotion : 29. Januar 2004Dedicated to my mother Odsuren Darjaa.
Χайрт ээждээ з ориул ав.iABSTRACT
Common root rot of pea, which is the major yield – reducing factor for pea
production world-wide is caused by the oomycete Aphanomyces euteiches. The
model legume Medicago truncatula was chosen to study the molecular mechanisms
of this disease. Young seedling of M. truncatula were effectively infected with
zoospores of A. euteiches and similar disease development as in pea was observed. A.
euteiches colonizes the root system and the disease symptoms occur mainly in the
plant root. Therefore the root tissue was used for the analyses. cDNA-AFLP method
was used to determine the time point of disease development where the most
transcriptional changes occur. The earliest time point determined, was chosen to
establish a SSH-cDNA-library enriched for the genes preferentially expressed in
plant root after infection with oomycete. In total 560 ESTs from this library were
sequenced and annotated. EST-annotations showed homologies to a number of
classical pathogenesis related and defence genes. Pre-screening of 192 SSH-cDNA
clones revealed 51 ESTs (26.5 %) showing increased mRNA accumulation in the
infected plant root. 46 from total of 560 annotated ESTs showed no homology to
previously identified M. truncatula genes. Moreover 10 of this new M. truncatula
genes were confirmed to be up-regulated in the roots after infection.
Two genes from the Kunitz-type trypsin inhibitor family were analysed for their
structure, expression and function. One of them, MtMir-1, is a gene induced in M.
truncatula roots by A. euteiches, as well as by symbiotic AM (arbuscular
mycorrhizal) fungi. Another one, MtMir-2, is induced in M. truncatula roots
exclusively during symbiotic and not during pathogenic interaction. Complete cDNA
sequences of both genes were determined. Moreover, promoter regions were isolated.
Promoter-reporter gene fusions were used for promoter studies.
Using dsRNA MtMir-1 gene was silenced in transgenic roots of M. truncatula.
Changes occurring in global gene expression pattern after silencing of MtMir-1 gene
were studied using microarray technique.
The transcription profile of M. truncatula root 30 minutes and 6 days after infection
with A. euteiches was also studied using microarrays.
Keywords: Medicago truncatula, Aphanomyces euteiches, transcription profilingiiZUSAMMENFASSUNG
Die gemeine Wurzelfäule bei der Erbse, der größte erntereduzierende Faktor
der Erbsenproduktion weltweit, wird durch den Oomyzet Aphanomyces euteiches
verursacht. Die Modell-Leguminose Medicago truncatula wurde ausgewählt, um die
molekularen Mechanismen dieser Krankheit zu untersuchen. Junge Sämlinge von M.
truncatula konnten effektiv mit Zoosporen von A. euteiches infiziert werden. Dabei
wurden ähnliche Befallssymptome wie bei der Erbse beobachtet. A. euteiches
kolonisiert das Wurzelsystem und Krankheitssymptome treten hauptsächlich dort
auf. Deswegen wurde Wurzelgewebe für die Analysen ausgewählt. Die cDNA-
AFLP-Methode wurde benutzt, um den Zeitpunkt der Krankheitsentwicklung zu
bestimmen, an dem die meisten Veränderungen auf Ebene der Transkription
auftreten. Der früheste Zeitpunkt dieser Analyse wurde ausgewählt, um eine SSH-
cDNA-Library zu etablieren, die angereichert ist für Gene, welche bevorzugt in der
Pflanzenwurzel nach Infektion mit dem Oomyzet exprimiert werden. Insgesamt
wurden 560 EST dieser Library sequenziert und annotiert. Die EST-Annotationen
zeigten Homologien zu einer Anzahl von klassischen Abwehr- und Pathogen-
bezogenen-Genen. Eine Analyse von 192 SSH-cDNA-Klonen ergab 51 ESTs (26,5
%), die eine erhöhte mRNA-Akkumulation in den infizierten Pflanzenwurzeln
aufwiesen. 46 der 560 annotierten ESTs zeigten keine Homologie zu vorher
identifizierten M. truncatula Genen. Darüber hinaus konnte für 10 dieser neuen M.
truncatula Gene eine Hochregulation in den Wurzeln nach Infektion belegt werden.
Zwei Gene der Kunitz-Typ Trypsin Inhibitoren Familie wurden auf ihre Struktur,
Expression und Funktion hin analysiert. Das eine, MtMir-1, ist ein Gen, welches in
M. truncatula –Wurzeln sowohl durch A. euteiches als auch durch symbiotische AM
(arbuskuläre Mykorrhiza) Pilze induziert wird. Das andere, MtMir-2, wird in M.
truncatula-Wurzeln ausschließlich während der Symbiose und nicht durch die
Pathogen-Interaktion induziert. Die kompletten cDNAs beider Gene wurden
bestimmt. Darüber hinaus wurden die Promoter-Regionen isoliert. Promoter-
Reporter-Gen-Fusionen wurden für Promoter-Analysen eingesetzt.
Mittels dsRNA wurde das MtMir-1–Gen in transgenen Wurzeln von M. truncatula
ausgeschaltet. Veränderungen der globalen Gen-Expressions-Muster durch das
ausgeschaltete MtMir-1-Gen wurden mittels Mikroarray-Technik analysiert.
Auch die Transkriptionsprofile von M. truncatula-Wurzeln 30 Minuten und 6 Tage
nach Infektion mit A. euteiches wurden mittels Mikroarrays untersucht.
Schlagwörter: Medicago truncatula, Aphanomyces euteiches, transkriptions profiliiiCONTENTS
ABSTRACT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i
CONTENTS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . iii
ABBREVIATIONS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vi
I INTRODUCTION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
II MATERIALS AND METHODS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
2.1 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
2.1.1 Chemicals, reagents, kits and equipment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
2.1.2 Organisms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
2.1.3 Vectors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 8
2.1.4 Oligonucleotides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.1.5 Buffers, solutions and media . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.1.6 Antibiotics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.2 Microorganisms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.2.1 Escherichia coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.2.1a Plasmid DNA extraction from E. coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.2.2 Agrobacterium rhizogenes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.2.3 Cultivation of Aphanomyces euteiches. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.2.4 Glomus intraradices. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.3 Plants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.3.1 Cultivation of Medicago truncatula. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.3.2 Inoculation of M. truncatula with A. euteiches. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.3.3 Visualisation of A. euteiches structure in plant roots . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.3.4 Inoculation of M. truncatula with G. intraradices . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.3.5 Staining of M. truncatula roots for arbuscular mycorrhizal structures . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.3.6 A. rhizogenes mediated transformation of M. truncatula hairy roots . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.3.7 Histochemical staining of transformed roots for GUS gene activity . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.4 Molecular biological methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.4.1 Genomic DNA extraction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.4.2 RNA extraction. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .