Novel functions of Drosophila melanogaster Argonaute2 for miRNA mediated silencing and early embryonic development [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Wibke Johanne Meyer

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• Publié le: 01 janvier 2006
• Nombre de lectures: 14
• Langue: English
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Extrait

Novel functions of Drosophila
melanogaster Argonaute2 for miRNA
mediated silencing and early embryonic
development





Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf

vorgelegt von

Wibke Johanne Meyer
aus Leer




März 2006
Aus dem Institut für Genetik
der Heinrich-Heine Universität Düsseldorf



















Gedruckt mit der Genehmigung der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf

Referent: Dr. H.-A. J. Müller
Koreferent: Prof Dr. R. Simon

Tag der mündlichen Prüfung: 23. April 2007









Für meine Familie
Abstract
Gene silencing mediated by small RNAs is a mechanism of post-transcriptional gene regulation. It is
common for many eukaryotic cells. Argonaute proteins are essential components of RNA mediated
silencing pathways. Unlike in other model organisms, in Drosophila different Argonaute proteins
have been assigned to different RNA silencing pathways. It was shown that Argonaute1 (Ago1) is
essential for microRNA (miRNA) mediated silencing while Argonaute2 (Ago2) is required for
silencing triggered by small interfering RNAs (siRNAs).
dop dopThis thesis investigated a mutant allele of ago2, the female sterile mutation ago2 . ago2
mutations cause developmental defects in cellularisation and microtubule-based transport in early
embryos. Drosophila Ago2 contains an unusual amino-terminus with two types of imperfect
glutamine-rich repeats (GRRs) of unknown function. This thesis demonstrates that the GRRs of
dop Ago2 are essential for the normal function of the protein. The ago2 alleles show an altered number
of GRRs. The main question was to find out how Ago2 as the key enzyme of the siRNA mediated
silencing pathway is involved in early embryogenesis. This thesis provides evidence that the
dop dopphenotypes of ago2 mutant embryos are not a consequence of siRNA mediated silencing. ago2
mutants are still able to respond to siRNA triggers. Therefore Ago2 must have at least one other
important function and might act in another regulatory pathways.
shortThis thesis identified a new isoform of Ago2 that lacks the GRRs, which was named Ago2 . The
dop dopgenetics of the ago2 alleles suggests that mutant Ago2 protein might negatively interfere with
short dop1 the function of Ago2 . Ago2 also interacts genetically with all other members of the Argonaute
dop1protein family. ago2 homozygous embryos that are reduced in ago1, piwi or aubergine (aub)
activity show an enhancement of the cellularisation phenotype in early embryos.
I propose that the developmental defects are caused by an inability to degrade maternal transcripts
at mid-blastula transition (MBT). The MBT is marked by switch from solely maternal to zygotic control
of embryogenesis. Downregulation of maternal genes is required at this stage of development.
Maternal transcripts might be degraded through a miRNA mediated silencing pathway. In this thesis
evidence is presented that miRNA miR-9a might be one possible regulator of maternal transcript
degradation.
Furthermore genetic analyses demonstrate that Argonaute proteins act in a partial redundant fashion
in early development. Ago1 and Ago2 have overlapping functions in the establishment of segment
polarity. In protein extracts, Ago1 and Ago2 can be coprecipitated suggesting that they are present in
the same protein complex. Genetic analysis revealed that Ago1 and Ago2 act in a partially redundant
manner to control the expression of the segment-polarity gene wingless in the early embryo.
Taken together, this work demonstrates novel functions for Ago2 and argues strongly
against a strict separation of Ago1 and Ago2 functions. Furthermore, the data suggest that
different Argonaute proteins might act together to control key steps of embryonic
development.
Zusammenfassung
Die Argonaut-Proteinfamilie besteht aus Proteinen, die essentiell für RNA vermittelte post-
transkriptionale Genregulation sind. Im Gegensatz zu anderen Modellorganismen wurde für
Drosophila gezeigt, dass verschiedene Argonaut-Proteine eine hohe Spezifität für verschiedene
RNA Regulationswege besitzen. So wurde das Modell kreiert, dass Argonaute1 (Ago1)
ausschließlich in der microRNA (miRNA) vermittelten Genregulation agiert und dass Argonaute2
(Ago2) essentiell für die Genregulation ist, die durch small interfering RNAs (siRNAs) ausgelöst wird.
dop Diese Doktorarbeit untersuchte die weibliche Sterilmutation ago2 in Drosophila melanogaster.
dopago2 -Mutationen führen zu Entwicklungsdefekten in der Zellularisierung und dem Mikrotubuli-
abhängigen Transport von Organellen in frühen Embryonen. Das Ago2-Protein in Drosophila besitzt
einen ungewöhnlichen Aminoterminus. Er besteht aus zwei Mustern nicht-perfekter Glutamin-
reichen Wiederholungen (GRRs). Die Funktion der GRRs war bisher nicht bekannt. Diese Arbeit
dopkonnte zeigen, dass die GRRs für die korrekte Funktion von Ago2 essentiell sind. ago2 -Allele
besitzen eine verringerte Anzahl der GRR-Wiederholungen. Ein Hauptpunkt dieser Doktorarbeit war,
zu klären, welche Rolle Ago2 als wichtigstes Enzym des siRNA vermittelten Regulationsweges in
dopder frühen Embryogenese spielt. Da der siRNA-Regulationsweg in ago2 -Embryonen
dopfunktionsfähig ist, kann der ago2 -Phänotyp nicht auf Defekte in diesem Mechanismus
zurückzuführen sein. Ago2 muss daher noch mindestens eine weitere wichtige Funktion besitzen
und könnte in anderen Regulationsmechanismen eine wichtige Rolle spielen. In dieser Arbeit konnte
shorteine neue Ago2-Isoform identifiziert werden, die Ago2 genannt wird und der die amino-terminalen
GRRs fehlen. Eine detaillierte genetische Untersuchung legt nahe, dass die embryonalen Defekte
dop short dop1 auf eine negative Interaktion zwischen Ago2 mit Ago2 zurückzuführen sind. Ago2 interagiert
dop1auch mit anderen Argonaut-Familienmitgliedern: ago1, piwi und aubergine ( aub). ago2 -
homozygote Embryonen, die eine verminderte Genaktivität von ago1-, piwi- oder aub-Aktivität
besitzen, zeigen einen verstärkten Phänotyp.
Die Ergebnisse dieser Arbeit führten zu dem Modell, dass die Defekte während der frühen
dop1Embryogenese daher resultieren, dass maternale Transkripte in ago2 -Mutanten während des
sogenannten Mid-blastula-Übergangs (MBT) nicht degradiert werden können. Der MBT zeichnet
sich dadurch aus, dass die Embryogenese nicht mehr von maternalen sondern von zygotischen
Genen gesteuert wird. Maternale Genprodukte werden während des MBT abgebaut und die
Degradierung maternaler Transkripte könnte durch miRNA-abhängige Prozesse erfolgen.
Genetische Daten in dieser Arbeit sprechen dafür, dass die miRNA miR-9a am Abbau maternaler
Transkripte beteiligt sein könnte.
Ago1 und Ago2 besitzen sich überschneidende Funktionen im Aufbau und Erhalt der
Segmentpolarität. Ago1 und Ago2 co-immunoprezipitieren in Proteinextrakten, was nahe legt, dass
beide Proteine im gleichen Proteinkomplex vorliegen. Desweiteren agieren Ago1 und Ago2
genetisch redundant in der Regulation des Segmentpolaritätgenes wingless im frühen Embryo. Die
Daten dieser Arbeit zeigen, dass Ago1 und Ago2 nicht zwei verschiedenen Regulationsmechanism
zugeordnet werden können, sondern zusammen arbeiten, um entscheidende Schritte der
Embryonalentwicklung zu steuern.