Purification, crystallization and structural analysis of the monomeric Photosystem II core complex from Thermosynechococcus elongatus [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Matthias Broser

Matthias Broser

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• Publié par: technische_universitat_berlin
• Publié le: 01 janvier 2010
• Nombre de lectures: 22
• Langue: Deutsch
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Extrait

Purification, crystallization and structural analysis
of the monomeric Photosystem II core complex
from Thermosynechococcus elongatus


vorgelegt von Diplom Biochemiker
Matthias Broser
aus Berlin

von der Fakultät II
– Mathematik und Naturwissenschaften –
der Technischen Universität Berlin zur Erlangung
des akademischen Grades Doktor der Naturwissenschaften
– Dr. rer. nat. –
genehmigte Dissertation



Promotionsausschuß:
Vorsitzender: Prof. Dr. R. Süssmuth
Berichter: Prof. Dr. Th. Friedrich
Berichter: Prof. Dr. W. Saenger
Berichter: Prof. Dr. A. Zouni

Tag der mündlichen Prüfung: 28. Oktober 2010

Berlin 2010

D83





Zusammenfassung
Zusammenfassung

Der in der Thylakoidmembran vorkommene Photosystem II-core Komplex (PSIIcc) ist
eines der Schlüsselenzyme der oxygenen Photosynthese. Er katalysiert die lichtinduzierte
Oxidation von Wasser. Bislang waren die zur Aufklärung der Funktionsweise notwendigen
und mittels Röngtenkristallographie gewonnenen Strukturinformationen auf die Verwendung
der homodimeren Form des PSIIcc beschränkt.
In dieser Arbeit wird erstmalig die Kristallisation und Strukturanalyse des monomeren
PSIIcc aus dem thermophilen Cyanobaterium Thermosynechococcus elongatus beschrieben.
Aufgrund eines verbesserten Präparations-Protokolls konnten hochreine, monomere PSIIcc
erhalten werden, die eine hohe Sauerstoffentwicklungsaktivität aufweisen. Das PSIIcc
Monomer weist alle 20 Protein-Untereinheiten auf, die in vollständigen, funktionellen
Komplexen vorkommen. Mittels dynamischer Lichtstreuung konnte die Homogenität der
PSIIcc Monomer Fraktion nachgewiesen werden. Erste Proteinkristalle konnten gezüchtet
werden, die zur orthorhombischen Raumgruppe C222 gehören und ein PSIIcc Monomer in 1
der asymmetrischen Einheit aufweisen. Die Analyse der Röntgen-Diffraktionsdaten erlaubte
es, ein erstes Strukturmodell des PSIIcc Monomers bei einer Auflösung von 3.6 Å zu erstellen.
Das Modell beinhaltet 19 Protein-Untereinheiten, 35 Chlorophyll a- und zwei Pheophytin a-
Moleküle, zwei Häm-Gruppen, das Nicht-Häm Eisen, elf Karotinoide, das primäre
Plastochinon Q , 22 Lipide und den Mn Ca Cluster des Wasser-oxidierenden Komplexes A 4
(WOC). Erwartungsgemäß ist die Struktur des PSIIcc Monomers im Wesentlichen identisch
mit der des dimeren Komplexes. Dennoch bilden die Strukturdaten eine neue Grundlage, um
die Rolle der Lipide und Protein-Untereinheiten im Zusammenhang mit der Oligomerisierung
des PSIIcc und dem Austausch des D1-Proteins zu diskutieren.
Erstmalig konnte eine deutlich andere Kristall-Packung des PSIIcc erhalten werden,
die folgende Vorzüge aufweist: (I) geringere Anisotropie der Röntgen-Diffraktion (Abhängig-
keit der Auflösung von der Kristallorientierung), (II) die Reduzierung der Orientierungen des
PSIIcc innerhalb der Einheitszelle und (III) die senkrechte Orientierung der Membran-
Normalen zu einer Kristallachse. Punkt (I) ist ein Vorteil für die Verbesserung der Röntgen-
Diffraktionsdaten, während (II) und (III) die Eignung von orientierungsanhängigen, spektro-
skopischen Methoden erhöht. Letzteres eröffnet neue Möglichkeiten die Struktur und
Funktionsweise des WOC aufzuklären. Erste Messungen bestätigen die Anwendbarkeit von
polarisierter Röntgenabsorptions-Spektroskopie auf diese neue Kristallform.
Die Akzeptorseite des PSIIcc ist das Wirkungsziel vieler kommerziell genutzter
Herbizide, jedoch fehlen bislang direkte Informationen über die Interaktion von Herbiziden
mit PSIIcc. In dieser Arbeit konnte, mittels Kristallen des dimeren PSIIcc, ein erstes Struktur-
modell von an PSIIcc gebundenen Terbutryn bei einer Auflösung von 3.4 Å erhalten werden.
Dieses Modell belegt, dass Triazin-Derivate in gleicher Art an den PSIIcc binden, wie an das
Reaktionszentrum aus Purpurbakterien. Bindungsstudien zeigen eine Abhängigkeit der
Terbutryn-Bindung vom funktionellen Zustand der Akzeptorseite des PSIIcc. Des Weiteren
weisen erste Strukturdaten eines Herbizids der Harnstoff-Klasse (Chlorbromuron) bei 3.7 Å
Auflösung, auf zwei unterschiedliche Bindungskonformationen dieses Herbizids hin.
An der Donorseite konnte eine Halogenid-Bindungsstelle im Abstand von 6.4 Å zum
Mn Ca Cluster lokalisiert werden. Dazu wurden Kristalle des dimeren PSIIcc verwendet, bei 4
denen das natürlich vorkommende Chlorid durch Bromid funktionell ersetzt wurde. Diese
Ergebnisse bestätigen, dass Bromid (und somit auch Chlorid) kein direkter Ligand des Mn Ca 4
Clusters ist, trotz der funktionellen Rolle bei der Wasser-Oxidation. Röngtenspektroskopische
Untersuchungen weisen auf eine Stöchiometrie von einem Bromid pro Mn Ca Cluster hin. 4
Aufgrund der Bromid-Position am Eingang zweier vermeintlicher Protonenkanäle ist eine
Funktion im Zusammenhang mit dem Proton-Transfer naheliegend.
i

ii Abstract
Abstract

The membrane-embedded Photosystem II core complex (PSIIcc) is one of the key
enzymes in oxygenic photosynthesis and uses light energy to oxidize water. To understand the
functional mode of this enzyme knowledge of its molecular structure is necessary. So far, the
information about the spatial structure of PSIIcc obtained from X-ray crystallography has
been restricted to the homodimeric form of the PSIIcc from thermophilic cyanobacteria.
This work describes the first crystallization and structural analysis of the monomeric
PSIIcc isolated from the thermophilic cyanobacteria Thermosynechococcus elongatus. Based
on an improved preparation protocol, it was possible to obtain a highly pure fraction of PSIIcc
monomer with high oxygen evolution activity. The PSIIcc monomer consists of all 20 protein
subunits known to be present in the complete functional complex. Dynamic light scattering on
this PSIIcc monomer fraction revealed the homogeneity needed for protein crystallization.
First protein crystals could be obtained, which belong to the space group C222 and contain 1
one monomer per asymmetric unit. The X-ray diffraction data derived from these crystals
yielded a first structural model of the PSIIcc monomer at a resolution of 3.6 Å. This model
includes the assignment of 19 protein subunits, 35 chlorophylls, two pheophytins, two heme
groups, the non-heme iron, eleven carotenoids, the primary plastoquinone Q , 22 lipids and A
the Mn Ca cluster of the water-oxidizing complex (WOC). As expected, the overall structure 4
of the PSIIcc monomer is essentially identical to its dimeric counterpart. Nevertheless, this
structure provides a new basis for the discussion of the role of lipids and protein subunits in
the oligomerization of PSIIcc and the assembly/disassembly during the repair cycle of
photodamaged subunit D1.
For the first time, a significantly different packing of PSIIcc could be obtained that
features the following advantages: (I) lower anisotropy of the X-ray diffraction (dependence
of resolution on crystal orientation), (II) a reduced number of orientations of PSIIcc within the
unit cell and (III) the orientation of the membrane normal perpendicular to one of the
crystallographic axes. Point (I) is crucial for further improving the quality of X-ray diffraction
data, whereas (II) and (III) make this crystal form more suitable for orientation-dependent
spectroscopy. This opens novel possibilities to elucidate the structure and function of the
WOC. Preliminary measurements of polarized X-ray absorption spectroscopy confirmed the
applicability of this method on the new crystal form.
The acceptor side of PSIIcc is the target for many commercially used herbicides, but
direct information about herbicide interactions with PSIIcc is lacking. In this work, the first
structural model of a triazine-type herbicide bound to PSIIcc at a resolution of 3.4 Å could be
obtained by crystallizing PSIIcc dimer in the presence of terbutryn. The structure reveals a
similar binding mode of triazines to the Q site of PSIIcc to that observed for the reaction B
center of purple bacteria. The analysis of terbutryn-binding to PSIIcc using isothermal
titration calorimetry and fluorescence spectroscopy suggests that herbicide binding is affected
by the functional state of the acceptor side. Furthermore, initial structural data on the binding
of a urea-type herbicide (chlorbromuron) to PSIIcc dimer at 3.7 Å resolution suggests two
different binding conformations of this herbicide at the Q site. B
On the donor side, one halide binding site could be located 6.4 Å away from the
Mn Ca cluster by using crystals of PSIIcc dimer, in which the naturally occurring chloride 4
was functionally replaced by bromide. This result confirmed the hypothesis that bromide (and
concomitantly chloride) is not a direct ligand of the Mn Ca cluster, despite its role in the 4
proper functioning of water oxidation. The stoichiometry of one bromide per reaction center
could be further supported by X-ray spectroscopy. Due to the location of the halide at the
entrance of two putative proton channels, a functional role in proton