Quantitative real-time RT-PCR based transcriptomics [Elektronische Ressource] : improvement of evaluation methods / Aleš Tichopád

Ales Spetic

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• Publié par: technische_universitat_munchen
• Publié le: 01 janvier 2004
• Nombre de lectures: 36
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 1 Mo

Extrait

Lehrstuhl für Physiologie
Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan
Technische Universität München


Quantitative real-time RT-PCR based transcriptomics:
Improvement of evaluation methods

Aleš Tichopád

Vollständiger Abdruck der von der Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für
Ernährung, Landnutzung und Umwelt der Technischen Universität München zur
Erlangung
des akademischen Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften

genehmigten Dissertation.



Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. L. Dempfle
Prüfer der Dissertation: 1. Priv.-Doz. Dr. M. W. Pfaffl
2. Univ.-Prof. Dr. J. Polster




Die Dissertation wurde am 29.06.2004 bei der Technischen Universität München
eingereicht und durch die Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für
Ernährung, Landnutzung und Umwelt am 16.08.2004 angenommen.
Table of content
ZUSAMMENFASSUNG........................................................................................................................3
SUMMARY.............................................................................................................................................5
ABBREVIATIONS ................................................................................................................................6
1 INTRODUCTION.........................................................................................................................7
1.1 Sample preparation, RNA extraction and cDNA synthesis .....................8
1.2 Principle of the quantitative real-time PCR..............................................9
1.2.1 Description of the PCR kinetics...........................................................13
1.2.2 The crossing point and the quantification event..................................16
1.2.3 Smoothing of the PCR amplification by empirical model....................18
1.3 Quantification strategies ...........................................................................21
1.3.1 Absolute quantification ........................................................................21
1.3.2 Relative quantification.........................................................................22
1.4 Amplification efficiency correction ..........................................................24
2 MATERIALS AND METHODS ...............................................................................................26
2.1 Sample preparation, RNA extraction, and cDNA synthesis ..................27
2.2 Real-time RT-PCR on the LightCycler....................................................27
2.2.1 Two-step real-time RT-PCR approach ................................................28
2.2.2 One-step real-time RT-PCR approach.................................................29
2.3 Data acquisition and statistical analysis ..................................................29
2.3.1 Quantification data acquisition ...........................................................29
2.3.2 Fluorescence data acquisition .............................................................30
2.3.3 Statistical tests .....................................................................................30
3 RESULTS AND DISCUSSION .................................................................................................31
4 CONCLUSION ...........................................................................................................................39
ACKNOWLEDGEMENTS .................................................................................................................40
REFERENCES................41

APENDIX
CURRICULUM VITAE (IN GERMAN)
LIST OF PUBLICATIONS
FULL LENGTH PAPERS
SUBMITTED MANUSCRIPTS
POSTERS
2
ZUSAMMENFASSUNG
Die quantitative Reverse-Transkription mit Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) ist
eine neue Methode, um geringste mRNA Mengen in biologischen Proben zuverlässig
zu bestimmen. Da die Stärke der Fluoreszenz des Reporterfarbstoffes proportional zur
gebildeten DNA-Menge sein sollte, ermöglicht die Aufnahme der Fluoreszenz eine
Darstellung des gesamten Reaktionsverlaufs. Demnach kann aus diesem
Reaktionsverlauf ein Rückschluss auf die eigentliche Ausgangskonzentration der
mRNA gezogen werden.
Während der RNA-Extraktion können hemmende Substanzen mit isoliert werden, die
im Folgenden die Reverse-Transkription (RT) als auch die PCR inhibieren und somit
zu einem probenspezifischen Verlauf der Reaktion führen. Zusätzlich variiert die
PCR-Effizienz nicht nur zwischen zwei Proben, sondern auch während der
Registrierung der PCR-Kurve einer einzelnen Probe. Aus diesem Grund ist die
korrekte Bestimmung der PCR-Effizienz jeder einzelnen Probe wie auch eine
zweckmäßige Standardisierung der Expressionsrohwerte eine wichtige Voraussetzung
für die korrekte Interpretation der Ergebnisse.
Um eine Lösung dieser Probleme zu finden, wurde eine Reihe von biologischen
Versuchen durchgeführt, in denen die RNA aus verschiedenen Geweben von Schaf
und Rind, so wie auch aus Zellkultur-Leukozyten extrahiert wurde. Eine konstante
Menge der RNA wurde dann in die cDNA übersetzt. Alle PCR-Läufe wurden mittels
eines LightCyclers durchgeführt und die Fluoreszenzrohdaten direkt von der
LightCycler Software gespeichert.
Mit Hilfe dieser biologischen Daten wurden mathematische Modelle sowie
statistische Verfahren entwickelt und validiert, mit denen man den optimalen
Quantifizierungsbereich ermitteln, die Effizienz der real-time PCR erstmals exakt
3
bestimmen, die Heterogenität zwischen experimentellen Proben untersuchen und
somit die Qualität der Expressionsergebnisse verfeinern kann. Aufbauend auf diese
Standardisierungen, wurde ein Entscheidungsalgorithmus für die zweckmäßige
Auswertung der qRT-PCR Daten entwickelt.
4
SUMMARY
Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) is a new method for
reliable quantification of low-abundance mRNA in biological samples. Since the
strength of the fluorescence signal emitted by the report dye is proportional to the
produced DNA amount, the fluorescence monitoring enables visualisation of the full
reaction trajectory. The reaction trajectory can be then extrapolated back to an input
concentration.
RNA extraction can introduce unwanted contaminants into the sample, inhibiting the
reverse transcription (RT) as well as the PCR reaction. These inhibitions cause then
the reaction to precede sample-specific. In addition, the amplification efficiency
varies not only between samples, but also along the recorded amplification trajectory
of a single sample. Consequently, a correct determination of each probe’s PCR
efficiency as well as a good standardization of the raw expression estimators is of
great importance for a correct interpretation of results.
To find a solution to above problems a series of biological experiments with RNA
extracted from various ovine and bovine tissues and from cultured leukocytes was
carried out. Constant amount of RNA was then reverse–transcribed to cDNA. All
PCR runs were performed on a LightCycler instrument and Fluorescence data was
saved in the LightCycler software.
Based on this data, mathematical models together with statistical procedures were
developed and validated. These can investigate the optimal quantification range and
exactly determine its real-time PCR efficiency. Additionally, methods were developed
to disclose heterogeneity between probes. All these procedures contribute to better
quality of results obtained. Resulting from these standardisations, a decision algorithm
for a proper analysis of the qRT-PCR data was designed.
5
ABBREVIATIONS

AMV Avian Myeloblastosis Virus
ANOVA analysis of variance
cDNA complementary DNA
CP crossing-point (raw PCR quantification unit)
Ct threshold cycle (raw PCR quantification unit)
DNA deoxyribonucleic acid
dsDNA double-stranded DNA
E real amplification efficiency
ε reported amplification efficiency
GAPDH Glyceraldehyd-3-Phosphate Dehydrogenase
IL-6 interleukin 6
KOD kinetic outlier detection
LPS Lipopolysacharid
MMLV Malloney murine leukemia virus
-MMLV H Malloney murine leukemia virus reverse transcriptase RNase H-minus
mRNA messenger RNA
PCR polymerase chain reaction
cPrP prion protein
qRT-PCR quantitative Reverse-Transkription mit Polymerase-Kettenreaktion
recDNA recombinant DNA
recRNA recombinant RNA
RNA ribonucleic acid
rRNA ribosomal RNA
RT reverse transcription
RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
ssDNA single-stranded DNA
WBC while blood cells
18S 18 S rRNA
28S 28 S rRNA
6
1 INTRODUCTION
Molecular diagnostics is a fast developing discipline of the economically important
field of biotechnologies. It has found its place in biological, agricultural, veterinary,
medical, and forensic science and praxis. Polymerase chain reaction (PCR) based
technologies have been established in most of laboratories involved in biomedical
science. Br