Regulation of translation initiation at the poliovirus IRES [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Juliane Hirnet

Hirnet, Juliane

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• Biologie

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• Publié par: justus-liebig-universitat_giessen
• Publié le: 01 janvier 2010
• Nombre de lectures: 39
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 6 Mo

Extrait

Regulation of Translation
Initiation at the Poliovirus
IRES

Inauguraldissertation zur Erlangung der Doktorwürde des
Fachbereichs Biologie und Chemie
an der Justus-Liebig-Universität
Gießen


Vorgelegt von
Juliane Hirnet
Mai 2010


Betreuer :
Prof. Dr. Gabriele Klug
Institut für Mikro- und Molekularbiologie
Fachbereich Biologie und Chemie
Justus-Liebig-Universität Gießen

Prof. Dr. Michael Niepmann
Biochemisches Institut
Fachbereich Medizin
Justus-Liebig-Universität Gießen
1

Danksagung
Ich möchte mich bei Prof. Gabriele Klug für die Übernahme der Erstbetreuung bedanken und
die freundliche Unterstützung bei der Anfertigung meiner Arbeit.

Vielen Dank an Prof. Michael Niepmann für die eigentliche Betreuung und die Möglichkeit
regelmäßig nach Russland zu gehen.

Many thanks to Prof. Ivan Shatsky at the Moscow State University for being my international
supervisor and for welcoming me into his lab at several occasions.

Vielen, vielen Dank meine Kolleginnen in der AG Niepmann, Christiane Bung, Carmen Fehr,
Dagmar Goergen und Jura Henke, die mir unglaublich geholfen haben die letzten drei Jahre
durchzuhalten ohne verrückt zu werden (das kann man natürlich so oder so sehen….).

Vor allem danke ich Christiane Bung für die letzten Monate, weil sie meine Arbeit so großartig
Korrektur gelesen hat und mein pausenloses Gerede in Raum 2 erträgt.

Außerdem bedanke ich mich bei all den anderen Leute die im Laufe der Zeit mit mir in einem
Labor gearbeitet haben: Dr.Christiane, Annike, Ralf, Pilar, Barbara, Ewald und John.

Vielen Dank Elena Tzima für die Vorarbeit, bei der Aufreinigung und Antikörperherstellung.

Thanks a lot (you don’t know how much) to everybody in the Shatsky lab in Moscow for
helping me with my project and making me feel welcome and part of the team even though I
don’t speak Russian.

Ich möchte mich auch beim IRTG für die Förderung und die Unterstützung bedanken.

Und am allermeisten möchte ich mich jedoch bei meiner Familie bedanken, die immer an
mich glaubt und mich bei jeder Entscheidung mit aller Kraft unterstützt und mir immer zuhört.
Ihr seid die Besten!


2

Summary
Poliovirus (PV) translation and replication can occur in neuronal cells where it causes
degeneration and lysis of cells leading to paralytic poliomyelitis. Other cell types are much
less affected by PV infection and do not support translation and replication of the virus as
well. Apart from the poliospecific receptor, the reasons for the tissue preference of poliovirus
may be found in its translation initiation via an internal ribosome entry site (IRES), which in
addition to cellular initiation factors uses proteins normally not involved in translation to
achieve efficient translation (ITAFs). Several ITAFs are known, but neither do these known
factors explain the tissue specificity of poliovirus nor are they sufficient to initiate translation at
the PV IRES using only purified components. Additional factors may be present in cells,
especially in neuronal cells, that are both necessary for translation initiation on the PV IRES.
One potential new factor, ErB3 binding protein (EbP1), was identified here to bind to the PV
IRES. Translation initiation complexes were formed with labelled Poliovirus IRES RNA in an
in vitro reconstitution system. A double labeled RNA allowed to identify 48S complexes in
sucrose gradients and to enrich proteins present in these complexes. As controls RNAs
containing the IRESs of Hepatitis C virus (HCV) and encephalomyocarditis virus (EMCV)
were used. One protein, specific for PV and EMCV was identified in the light RNA peak but
not in the 48S peak. It was identified by mass spectrometry as EbP1, which is a known ITAF
for the IRES of Foot-and-mouth-disease virus. However, its role in PV translation initiation
seems to be inhibiting rather than stimulating since it could not be found in 48S complexes.
Additionally I identified a neuron specific microRNA (miRNA) that stimulates translation at the
Poliovirus IRES. By screening the poliovirus IRES sequence for potential target sites for
miRNAs that are preferentially expressed in neuronal cells, I found sequences partially
complementary to three neuron-specific miRNAs, miRNA-127, miRNA-326 and miRNA-422a.
These miRNAs were co-transfected into cultured cell-lines together with a poliovirus IRES
reporter RNA. Of these miRNAs, only miRNA-326 enhanced poliovirus translation efficiency.
The target site for miRNA-326 is located in a loop of the central IRES domain IV.
Mutagenesis of this miRNA-326 target site disabled the stimulation by added miRNA-326,
indicating a physical interaction of miRNA-326 with the poliovirus IRES. However, this
mutation could only be partially rescued by a miRNA with a complementary mutation in the
seed sequence of miRNA-326. Since two binding sites of miRNA-326 in the 5’ untranslated
region of PV are identical with binding sites for the known ITAF PCBP2, a connection
between those two factors may be assumed.

3

Zusammenfassung
Poliovirus (PV) Translation und Replikation findet in neuronalen Zellen statt. Infizierte Zellen
werden degradiert oder lysiert, was zum Krankheitsbild der Kinderlähmung führt. Andere
Gewebe sind von Polioinfektionen weit weniger betroffen, da sie Translation und Replikation
des Virus nicht unterstützen. Der Grund für die Gewebespezifität von Poliovirus liegt neben
dem Rezeptor auch an der Initiation der Translation, die mit Hilfe einer internen Ribosomen
Eintrittsstelle (IRES) realisiert wird. IRES abhängige Translation benötigt neben zellulären
Initiationsfaktoren auch andere zelluläre Proteine (ITAFs), welche normalerweise nicht an der
Translation beteiligt sind. Mehrere ITAFs für PV sind bekannt, allerdings kann durch sie weder
die Gewebespezifität von PV erklärt werden, noch sind all diese Faktoren ausreichend, um in
aufgereinigter Form Translation durch die PV IRES zu initiieren. Es muss also noch weitere
Faktoren geben, die für die Translation durch die PV IRES in neuronalen Zellen notwendig
sind.
Ein neuer potentieller ITAF, ErB3-binding protein (EbP1), wurde in dieser Arbeit identifiziert.
Dafür wurden Translationsinitiationskomplexe an der PV IRES gebildet. Eine doppelte
Markierung erlaubt sowohl die Identifikation der 48S Komplexe im Gradienten, als auch eine
Isolierung von RNA bindenden Proteinen aus diesen Komplexen. Als Kontrolle wurden RNAs
mit der Hepatitis C Virus und der Encephalomyocarditis Virus (EMCV) IRES eingesetzt. Ein
Protein konnte in den leichten Sucrose Fraktionen an der PV und EMCV IRES beobachtet
werden, jedoch nicht in den 48S Komplexen. Dieses Protein wurde durch
Massenspektrometrie als EbP1 identifiziert. EbP1 wurde bereits als ITAF für das Maul- und
Klauenseuche Virus identifiziert.
Zusätzlich wurde eine neuronen-spezifische mikroRNA (miRNA) identifiziert, welche die
Translation an der PV IRES stimuliert. Dafür wurden mehrere neuronen-spezifische miRNAs,
miRNA-127, miRNA-326 und miRNA-422a ausgewählt, die Bindestellen in der PV IRES
haben. Diese miRNAs wurden zusammen mit einem PV IRES Reporterkonstrukt in Zelllinien
transfiziert. Nur miRNA-326 zeigte eine Stimulation der Translation. Die Bindestelle für miRNA-
326 befindet sich in einer nicht gepaarten Region innerhalb von Domäne IV in der Mitte der PV
IRES. Mutagenese dieser miRNA-326 Bindestelle verhinderte die Stimulation durch miRNA-
326. Der Effekt konnte jedoch mit einer kompensatorisch mutierten miRNA nur teilweise
wieder hergestellt werden. Beide Bindestellen für miRNA-326 in der PV IRES sind mit
Bindestellen für den ITAF PCBP2 identisch, daher kann ein Zusammenspiel dieser beiden
Faktoren in der Translation angenommen werden.

4

Table of content
Danksagung ................................................................................................................... 2
Summary ........................................................................................................................ 3
Zusammenfassung ......................................................................................................... 4
Table of content .............................................................................................................. 5
Abbreviations .................................................................................................................. 7
Introduction ................................................................................................................... 11
Poliovirus .......................................................................................................................... 11
Translation initiation .......................................................................................................... 12
Eukaryotic cap-dependent translation initiation ............................................................. 12