Régulation transcriptionnelle du gène RHOH et potentielles cibles de la protéine dans différents modèles hématopoïétiques normaux et leucémiques, Transcriptional regulation of RHOH gene and potential targets of RhoH protein in different normal and leukemic hematopoietic cells

Laure Delestré

Description

Sous la direction de Sylvie Zouitina-Galiègue
Thèse soutenue le 17 décembre 2010: Lille 2
RhoH est une petite protéine G de la famille Rho constitutivement activée. Cette protéine, exclusivement exprimée dans les cellules hématopoïétiques, intervient dans le développement du système immunitaire. Elle régule la croissance des cellules souches et des progéniteurs hématopoïétiques, la différenciation des lymphocytes T et la signalisation des récepteurs TCR, BCR et FcεRI présents respectivement à la surface des cellules T, B et des mastocytes. La dérégulation de l’expression du gène RHOH est un facteur de progression tumorale dans certaines leucémies. En effet, l’augmentation de son expression dans la Leucémie Lymphoïde Chronique (LLC) et sa répression dans la leucémie à tricholeucocytes (HCL) sont des évènements impliqués dans la progression de ces maladies. La LLC et l’HCL sont deux pathologies affectant des lymphocytes B matures mais, pour cette dernière, les cellules présentent un état de différenciation plus avancé. RhoH module donc différemment les processus de prolifération, de migration et de survie cellulaires selon le stade de maturation des cellules, suggérant que son expression soit finement régulée dans les cellules hématopoïétiques. Au laboratoire, notre équipe a mis en évidence la répression de RHOH dans l’HCL, responsable de la progression de cette maladie. Cette expression anormale est le résultat d’une diminution des transcrits RHOH initiés en amont de l’exon 4. Le même phénomène a également été observé dans la leucémie T de l’adulte (ATL). L’HCL et l’ATL sont deux maladies caractérisées par une prolifération anormale de cellules matures activées de type B (HCL) ou de type T (ATL). Nous avons donc projeté de comprendre les mécanismes moléculaires intervenant dans la régulation physiologique du gène RHOH au cours de l’activation lymphocytaire B et T ; puis de mettre en évidence les évènements responsables de la répression de RHOH dans l’HCL et l’ATL. Notre objectif serait d’y restaurer l’expression de RHOH et ainsi d’essayer de contrecarrer le phénotype leucémique, ceci dans le but de proposer de potentielles nouvelles cibles thérapeutiques dans ces deux leucémies, dont les traitements sont soit inefficaces (ATL), soit satisfaisants mais associés à des taux de rechutes assez élevés (HCL). Notre projet s’est tout d’abord orienté sur l’étude de la régulation normale du gène RHOH dans les cellules B et T. Nos résultats ont permis de montrer que l’expression du gène RHOH est principalement due à l’activité du promoteur P3 dans les lymphocytes B et T normaux et dans des lignées cellulaires lymphoïdes. Dans les lignées lymphoïdes B, le promoteur P3 a été caractérisé et correspond à la séquence -236/+67, en regard du site d’initiation de la transcription. Nous avons observé une augmentation de son activité suite à l’activation de ces cellules par un analogue du diacylglycérol (DAG), suggérant que des facteurs de transcription comme AP1, complexe formé des membres des familles Jun et Fos, sont impliqués dans la régulation du gène RHOH dans des lignées cellulaires lymphoïdes B. Nos résultats ont également permis de mettre en évidence : d’une part, la fixation de JunD sur le promoteur P3, par immunoprécipitation de la chromatine et son rôle de régulateur négatif dans la transcription de RHOH ; d’autre part, l’importance des membres de la famille Fos dans l’expression de ce gène, dans la lignée lymphoïde B Raji. Dans les lymphocytes T, l’activation des cellules par des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 a permis d’observer une variation biphasique de l’expression des transcrits RHOH initiés en amont de l’exon 4, au niveau du promoteur P3 : tout d’abord, une forte augmentation du taux des ARN messagers, reproduite par l’utilisation d’un ionophore pour le calcium, suivie d’une répression, mimée par l’analogue du DAG. Afin de mettre en évidence les facteurs de transcription régulant ces mécanismes, nous avons isolé le promoteur P3 et étudié les variations de son activité dans les cellules T, en présence ou non soit du ionophore, soit de l’analogue du DAG. Nos données préliminaires montrent la présence potentielle de sites de fixation pour des facteurs de transcription régulés par la voie calcique et impliqués dans l’activation de RHOH (entre les positions –236 et –201) et pour des facteurs de transcription régulés par la voie du DAG et entraînant la répression du gène (entre les positions –583 et -380). La nature des sites de fixation et des facteurs de transcription impliqués n’a cependant pas encore pu être déterminée. Nous avons d’autre part étudié, en parallèle, les conséquences de l’induction de RHOH sur les voies de signalisation dans les lymphocytes T activés. Le second axe de notre projet a été la recherche de mécanismes moléculaires impliqués dans la dérégulation de RHOH dans la leucémie à tricholeucocytes et la leucémie T de l’adulte. Nos résultats, obtenus uniquement dans l’HCL, ont permis de montrer que la répression de RhoH observée dans cette leucémie et caractérisée par une diminution des transcrits initiés en amont de l’exon 4, est due à une inhibition de l’activité du promoteur P3. Nous avons également montré que l’activation de la voie de signalisation du DAG lève la répression de RHOH dans des lignées cellulaires modèles de l’HCL. Même si ce phénomène n’est pas spécifique des cellules HCL, il s’agit cependant d’une information importante : des facteurs de transcription régulés par cette voie, tel AP1, permettraient la restitution de l’expression de RHOH dans l’HCL. L’étude du complexe AP1 dans ce mécanisme a permis de montrer que la modulation de l’expression de chacun des membres de la famille Jun ne permet pas une telle levée de répression ; mais ce résultat est obtenu en inhibant les voies de signalisation de la famille Fos. Les facteurs de transcription Fos sont donc importants dans le contrôle de la transcription de RHOH dans l’HCL et pour la restitution de son expression dans cette maladie. Dans des lignées cellulaires lymphoïdes modèles de l’ATL, aucune répression du promoteur P3 de RHOH n’a pu être mise en évidence ; cependant, certaines régions de ce promoteur n’ont pas encore été étudiées. Des études complémentaires devraient être donc menées. Notre travail a ainsi permis d’apporter de nouvelles informations sur la régulation de RHOH au cours de l’activation lymphocytaire B et T. Nos résultats ont également permis de mettre en évidence une voie de signalisation et des facteurs de transcription, dont l’activation entraînerait une levée de répression du gène RHOH dans la leucémie à tricholeucocytes. Ces résultats prometteurs nécessitent d’être approfondis et pourraient permettre l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques dans la leucémie à tricholeucocytes.
-Gène RHOH
The hematopoietic GTPase RhoH is an atypical family member of the Rho GTPases as it is constitutively active and not regulated through the classical cycling between GTP- and GDP-bound state. A number of studies investigated the role of RhoH in hematopoietic cells. RhoH is associated with regulation of proliferation of hematopoietic stem and progenitors. This protein exhibits essential functions in thymocyte development and TCR, BCR, FcεRI signaling in T, B and mast cells, respectively. Recently, a report provided evidence implicating RhoH overexpression in the initiation and progression of Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL); on the other hand, RhoH underexpression has been implicated in the progression of Hairy Cell Leukemia (HCL). Most data indicate that RhoH is an important regulatory molecule with antagonistic functions in proliferation, adhesion or migration in hematopoietic cells and therefore must be accurately regulated. Previous experiments from our laboratory reported that HCL is characterized by abnormal underexpression of RhoH, corresponding to a decreased level of RHOH mRNA initiated upstream of exon 4. Reconstitution of RhoH expression reduced proliferation, adhesion and migration that is central in HCL pathogenesis. Transcriptional repression of this gene was also observed in another leukemia, Adult T cell Leukemia (ATL). Aimed at identifying new therapeutic targets to combat HCL and ATL, we wanted to examine molecular mechanisms implicated in RhoH underexpression in both diseases. HCL and ATL are chronic lymphoproliferative disorders characterized by proliferation of mature cells with memory B cell or T-helper cell phenotype, respectively. In the first part of our work, we wanted to investigate molecular mechanisms mediating normal RhoH expression in activated B and T cells, as well as induced pathways; in the second part, we tempted to identify transcription factors implicated in RhoH repression in HCL and ATL. Firstly, our work has focused onto physiological expression of RHOH gene in B and T cells. We showed that RHOH gene expression observed in these cells was mostly due to transcriptional activity of P3 promoter, upstream of RHOH exon 4. The promoter was isolated spanning nucleotides -236/+67 relative to the transcription start site, in B cells. B cells stimulation by PMA (Phorbol-12-Myristate-13-Acétate) induced an increase of P3 promoter activity. PMA is a DiacylGlycerol (DAG) analogous. This result suggested that transcription factors related to DAG pathway stimulation, like AP1 (Activator Protein 1), could be responsible for RHOH expression in B cells. We could show that the Jun family member JunD is able to bind to endogenous P3 promoter and can act as a repressor of RHOH expression in a B cell line, Raji. Other Jun family members seemed not to be implicated in this regulation. We also reported that Fos family members are important in RHOH expression. Our results suggest that the transcription factor AP1 could regulate this process in B cells. T cell activation by antibodies directed against CD3 and CD28 induced biphasic kinetics of expression of RHOH mRNA initiated upstream of exon 4. We observed a high increase of RHOH transcript level, mimicked by use of ionomycin, followed by an important decrease, mimicked by use of PMA. RHOH P3 promoter was isolated in a T cell line, Jurkat, then we investigated putative binding sites for transcription factors, which could be implicated in this biphasic event in T cells. Our preliminary results have shown that some potential binding sites for transcription factors related to calcium pathway and inducing RHOH expression are present between nucleotides -236 and -201; also sites for transcription factors induced by DAG pathway and repressing this gene are present between nucleotides -583 and -380. However, transcription factors have not yet been identified. In addition, we investigated signaling pathways mediated by increased RHOH gene expression induced during T cell activation. Secondly, our work has focused onto molecular events that could be involved in RHOH repression in HCL and ATL. We found that the underexpression of RHOH mRNA observed in HCL is mediated by repression of P3 promoter. Treatment of HCL cells with PMA led to an increased RHOH promoter activity, suggesting that the DAG pathway could reconstitute RHOH gene expression in these cells. These results may indicate that transcription factors related to DAG pathway, like AP1, could play a role in RHOH gene expression reconstitution in HCL. By investigating AP1 implication in this event, we provided evidence that Fos family members may control RHOH expression in this disease, and that any Jun family members were not implicated. In ATL, we could not correlate RHOH repression to P3 promoter deregulation. Because all promoter regions have not been studied up to now, our work needs to be completed by additional investigation. We have described in this work new molecular mechanisms involved in normal RHOH expression in B and T lymphocytes. We also are the first team having reported a signaling pathway which could reconstitute RHOH expression in HCL. It will therefore be of interest to identify transcription factors mediating regulation of RHOH expression, and therefore novel potential therapeutic targets to combat this malignancy.
Source: http://www.theses.fr/2010LIL2S036/document

Informations

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• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 7 Mo

Extrait

UNIVERSITÉ DU DROIT ET DE LA SANTÉ – LILLE 2

THÈSE
Présentée pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DU DROIT ET DE LA SANTÉ
DISCIPLINE : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
Spécialité : Biochimie et biologie moléculaire

par
Laure DELESTRÉ

Régulation transcriptionnelle du gène RHOH et potentielles cibles
de la protéine dans différents modèles hématopoïétiques normaux
et leucémiques

Thèse dirigée par le Dr Sylvie ZOUITINA-GALIEGUE

Soutenue le 17 Décembre 2010 devant le Jury composé de :

Professeur Bruno QUESNEL Président
Docteur Josiane PIERRE Rapporteur
Docteur Nadine VARIN-BLANK Rapporteur
Professeur Xavier TROUSSARD Examinateur
Docteur Carl Simon SHELLEY Examinateur
Docteur Sylvie ZOUITINA-GALIEGUE Directeur de Thèse
tel-00612958, version 1 - 2 Aug 2011







Les cellules leucémiques persistent chez l'hôte malgré les traitements. Cette persistance
des cellules tumorales, en particulier à long terme, constitue le facteur majeur d'échec des
stratégies thérapeutiques mises en place. Notre équipe étudie les facteurs pouvant contribuer au
phénomène de persistance des cellules leucémiques chez l’hôte, principalement au cours des
hémopathies malignes de type leucémies aigues et leucémies myéloïdes chroniques. Le Docteur
Sylvie Zouitina-Galiègue en collaboration avec le Docteur Carl Simon Shelley ont mis en
évidence la répression du gène RHOH dans deux hémopathies malignes : la leucémie T de
l’adulte et la leucémie à tricholeucocytes, un facteur de progression tumorale dans cette dernière.
Ces deux chercheurs sont tous deux les porteurs de mon projet de thèse. Le Docteur Sylvie
Zouitina-Galiègue possède des connaissances pointues sur l’expression du gène RHOH et les
méthodes pour étudier sa régulation, et le Docteur Carl Simon Shelley a des acquis aussi bien sur
la régulation transcriptionnelle et les techniques associées, mais aussi sur les deux pathologies
étudiées. Ils sont donc complémentaires sur ce projet. Même si officiellement, le Docteur Sylvie
Zouitina-Galiègue est le directeur de cette thèse. Officieusement, ces deux personnes ont
participé toutes deux à la gestion de ce projet. Le Docteur Carl Simon Shelley n’est membre du
jury pas en tant qu’examinateur, mais en tant que co-directeur de thèse pour moi.

tel-00612958, version 1 - 2 Aug 2011







Tumor progression is characterized by the persistence of tumor cells in hosts, in spite
of therapy. Recurrence from minimal residual disease is a major cause of cancer death. Thus,
the understanding of how cancer cells become and remain persistent may lead to new
strategies, to prevent relapse. In our team, we focused to identify new findings, which offer
new opportunities to design specific treatments of hematological malignancies as acute or
chronic leukemia, and to modify the balance in favor of the host immune response. Sylvie
Zouitina-Galiègue, Ph.D., and Carl Simon Shelley, Ph.D., have collaborated with each other
and have shown that the RHOH gene is abnormally underexpressed in Adult T cell Leukemia
(ATL) and Hairy Cell Leukemia (HCL). This phenomenon contributes to tumor progression
in HCL cells. The project aims at identifying molecular mechanisms in order to reconstitute
RHOH gene expression in HCL and ATL, and develop novel treatments for these
malignancies. Sylvie Zouitina-Galiègue is a specialist in RHOH gene expression in
hematopoietic cells, and Carl Simon Shelley is an expert in transcriptional regulation and has
already described the transcriptional deregulation of CD11C by JunD in HCL. So, officially,
Sylvie Zouitina-Galiègue is the director of this thesis. In the reality, they contributed equally
to the Ph.D. supervising. Consequently, Carl Simon Shelley will participate in this jury as a
supervisor and not as an examinator.


tel-00612958, version 1 - 2 Aug 2011Remerciement

Je tiens à exprimer tout d’abord mes remerciements aux membres du jury, qui ont
accepté d’évaluer mon travail de thèse.


Merci au Professeur Bruno Quesnel, Professeur des Universités – Praticien Hospitalier du
Service des Maladies du Sang du Centre Hospitalier et Universitaire Huriez de Lille et
Responsable de l’équipe 3 de l’unité U837 INSERM du Centre de Recherche Jean Pierre Aubert
d’avoir accepté de présider le jury de cette thèse et de m’avoir accueillie au sein de son équipe,

Merci à MMes les Docteurs Nadine Varin-Blank, Directeur de Recherches au sein de l’unité
UMR U978 INSERM, à Bobigny et Josianne Pierre, Directeur de Recherches au sein de l’unité
U749 INSERM, à Chatenay-Malabry, d’avoir accepté d’être les rapporteurs de ce manuscrit.

Merci également au Professeur Xavier Troussard, Professeur des Universités – Praticien
Hospitalier, Chef de Service du Laboratoire d’Hématologie Biologique du Centre Hospitalier et
Universitaire de Caen, pour avoir accepté d’examiner mon mémoire et de faire partie de mon
jury de thèse.

Je tiens à remercier plus particulièrement mes deux directeurs de thèse, le Docteur Sylvie
Zouitina-Galiègue, Chargé de Recherches de l’équipe 3 de l’unité U837 INSERM du Centre de
Recherches Jean Pierre Aubert, Lille, et le Docteur Carl Simon Shelley, Directeur du
Laboratoire d’Hématologie/Oncologie du Centre Médical Gundersen Lutheran, La Crosse,
Wisconsin, Etats-Unis. Leurs connaissances, leur logique et leur façon de penser ont été pour
moi d’une grande valeur. Leur compréhension, leur encouragement et leurs conseils personnels
ont été un enrichissement pour la réalisation de cette thèse. Je vous remercie tous deux pour vos
commentaires précis et constructifs que vous avez apportés tout au long de ce travail.
Merci à toi Sylvie, tu as toujours été présente, à tous moments, dans les moments les plus forts et
aussi les plus durs mais aussi au cours de nombreux week ends.
Merci à toi Simon, malgré la distance, tu as également été présent et tu as participé pleinement à
nos réflexions. Merci également pour tes déplacements annuels au laboratoire.
Merci infiniment.

I would like to express my deep and sincere gratitude to my supervisors, Doctor Sylvie
Zouitina-Galiègue, Researcher of Unity U837 INSERM of Jean Pierre Aubert Research
Center, Lille, and Doctor Carl Simon Shelley, Ph.D., Director of Hematology/Oncology
Research, Gundersen Lutheran Medical Center, La Crosse, Wisconsin USA. Their
knowledge and their logical way of thinking have been of great value for me. Their
understanding, encouraging and personal guidance have provided a good basis for the
present thesis. Thank you very much for your detailed and constructive comments, and
for your important support throughout this work.
Thank you Sylvie, you were really implicated in my work, all the time, at good and hard
moments and during weekends too.
Thank you Simon, even if you were far away, you were really implicated too in this
project and you participated every times in our reflections. Thank you too for your
comings every year.
Thank you very much.
tel-00612958, version 1 - 2 Aug 2011Un grand merci au Professeur Jean Krembel et au Conseil d’Administration de l’Institut pour la
Recherche sur le Cancer de Lille, pour leur soutien financier. Sans eux, cette fin de thèse
n’aurait pas été possible.

Merci au Docteur Maud Collyn d’Hooghe, Ex-Directeur Administratif de l’Institut Fédératif de
Recherche 114 de l’Institut de Médecine Prédictive et de Recherche Thérapeutique, pour le
maintien tout au long de cette thèse d’une plateforme de quantification de produits de PCR en
temps réel toujours fonctionnelle et au personnel de l’IFR114 pour leur accueil chaleureux,

Je tiens à remercier aussi Claude Denis, dont l’aide sur le plan technique et les grandes qualités
humaines m’ont beaucoup aidée lors de mes deux premières années de thèse,

Merci également à Nathalie Jouy, pour les tris cellulaires qu’elle a effectués pour ce travail, au
Docteur Xavier Thuru, pour la mise en place d’un nouveau système de Western Blot qui m’a fait
gagner beaucoup de temps et qui m’a réconciliée avec cette technique,

Merci à la Plateforme AGILENT-AFFYMETRIX, pour la réalisation des expériences de
transcriptome, et