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• Publié par: Ornyo
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Extrait

ED 352 : Physique et sciences de la matière

Centre de Physique Théorique – UMR 6207

Recherche, au delà du mouvement Brownien, de forces de recrutement sélectives

entre partenaires de réactions biochimiques au niveau sub-cellulaire

Directeur de thèse

: Marco PETTINI (

pettini

@cpt.univ-mrs.fr

)

Laboratoire

:

Centre de Physique Théorique (CPT)

Descriptif du Projet:

Les progrès en biologie

moléculaire et cellulaire sont étroitement liés à la connaissance de la

structure des interactions fonctionnelles entre bio-molécules telles que ADN, ARN et protéines. Bien

qu’à l’état basal ces processus biochimiques essentiels ne présentent généralement pas

d'organisation spatiale stricte, leurs mécanismes semblent pour la plupart contraints à un schéma

temporel - ou

dynamique

- précis. De configuration peu comparable avec un réacteur chimique, les

cellules vivantes sont le théâtre de réactions chimiques catalysées par de nombreuses enzymes dont

l'activité cruciale augmente les taux de réaction des bio-molécules de plusieurs ordres de grandeur

(jusqu'à obtention de cinétiques raisonnables) en affaiblissant les barrières d'énergie libre. De même,

les protéines interagissant avec l'ADN/ARN (hélicases, polymérases, nucléases, recombinases...)

modulent les mécanismes essentiels impliquant les acides nucléiques de manière à assurer

réparation et duplication de l'ADN, expression génique et recombinaisons, avec une efficacité

étonnante. Du point de vue de la physique, une question fondamentale reste toutefois sans réponse.

Considérant des réactions chimiques essentiellement stéréo-spécifiques, la mise en contact d'un

minimum de deux partenaires présentant des orientations spatiales définies est nécessaire à

l'initiation d'une réaction donnée. De plus, l'ensemble de ces partenaires évoluent dans un milieu dont

le principal élément, l'eau, présente une constante diélectrique considérable et constitue donc

vraisemblablement une barrière réduisant de manière drastique toute interaction électrostatique entre

bio-molécules. Compte tenu de ces observations, comment les divers interacteurs d'un processus

biochimique donné sont-ils efficacement amenés à se rencontrer (

i.e.

quels sont les mécanismes

permettant à une protéine de recruter le bon co-effecteur ou d'atteindre sa cible spécifique sur une

chaîne d'ADN/ARN dans un cyto/nucléoplasme opaque)? En d'autres termes, quels types de forces

physiques sont à même d'amener tous les interacteurs au bon endroit, dans le bon ordre, en un

temps raisonnable et d'assurer ainsi toutes les fonctions cellulaires?

L’hypothèse usuellement avancée pour répondre ces questions fait appel à l’agitation brownienne.

Sous les conditions de pression et de température standards d’une cellule, les molécules d’eau sont

animées de mouvements chaotiques génératrices de chocs sur les éléments plus imposants du

milieu, la somme de ces chocs résultant en une force d’intensité et de direction aléatoires. Les macro-

molécules en solution seraient ainsi soumises à une diffusion aléatoire finissant par les amener à

rencontrer leur partenaire après un temps plus ou moins long. Cette hypothèse se révèle toutefois

peu convaincante. En effet, une estimation plus poussée des cinétiques des processus biochimiques

évoqués précédemment met en évidence une incohérence flagrante. La plupart des protéines sont

notamment capables d’atteindre leurs cibles cellulaires 100x (voir davantage) plus rapidement que

prédit par les taux de diffusion brownienne. L’existence de mécanismes dits de ‘diffusion facilitée’ a

récemment été proposée [1], mais ces phénomènes ne semblent jouer un rôle que dans la toute

dernière étape de reconnaissance mutuelle des partenaires biochimiques, laissant sans réponse la

problématique du recrutement à longue distance. Dans ce contexte, il est intéressant de noter que

l’écrantage

électrostatique

imposé par les molécules d’eau ne peut éliminer toute action de forces

électrodynamiques

à longue portée. En pratique, les vibrations internes des atomes (ou sous-groupe

d'atomes) composant une macro-molécule biologique génèrent un profil de fréquences (ou spectre)

des variations temporelles de leurs moment dipolaire local et global. Dans des conditions favorables

en terme de quantité d'énergie, un ensemble de dipôles est susceptible de subir un phénomène de

pseudo-condensation de type Bose-Einstein, leur spectre se concentrant sur une unique fréquence

de sorte qu'une bio-molécule se comporte alors comme un seul dipôle oscillant géant [2]. Un tel

dipôle électrique vibrant peut être 'perçu' par un autre (et à distance) à condition que les deux entités

oscillent à une fréquence annihilant l'écran électrostatique de l'eau, la rendant 'transparente' aux

forces électrodynamiques. L'existence de telles forces à longue portée entre deux dipôles électriques

oscillants a été prédite par les travaux de H. Fröhlich [3] qui a, en outre, avancé l'hypothèse que ces

phénomènes électrodynamiques pourraient être cruciaux pour expliquer l'important pouvoir

catalytique des enzymes et, plus généralement, la cohérence à grande échelle des systèmes

biologiques [4].

Ces forces sélectives à longue portée sont-elles réellement actives à l'échelle moléculaire dans la

matière vivante? Pour le vérifier, nous proposons de tirer parti d’une combinaison d'approches de

biologie moléculaire et d’ outils théoriques et expérimentaux de micro-physique. En effet, de manière

surprenante, aucun test expérimental n'a pour l'heure été proposé pour infirmer ou confirmer les

prédictions de Fröhlich. L’accès possible sur ce campus à des technologies de pointe permettant

d’obtenir des cinétiques enzymatiques à haute résolution (spectrométrie à corrélation de fluorescence

ou FCS [5]) devrait fournir un ensemble idéal de protocoles expérimentaux pour mettre en évidence

l'existence de forces sélectives a longue portée intervenant sur des partenaires biochimiques. Nous

projetons de mesurer en temps réel des cinétiques de réactions de clivage endonucléolytique de

l'ADN par des endonucléases de restriction (

ex.

EcoRI, KpnI); ou d'une machinerie plus complexe de

recombinaison de l'ADN, RAG1/2, qui intervient dans l'élaboration du répertoire antigénique des

cellules immunitaires. Associant une expertise reconnue en physique des intéractions à longue portée

dans les systèmes dynamiques (groupe de M. Pettini au CPT, UMR 6207), en mesure de diffusion à

l’échelle unicellulaire (groupe de D. Marguet, CIML/CNRS UMR 6102) et en biologie moléculaire

(groupe de P. Ferrier, CIML/CNRS UMR 6102), nous suivrons précisément les cinétiques et les

activités catalytiques de ces systèmes modèles. Nous adapterons les réactions de clivage à

l'utilisation de la spectrométrie à corrélation de bi-fluorescence en microscopie confocale comme

décrit par Kettling

et al

. [5]. Cette méthodologie est notamment disponible au CIML dans le groupe de

D. Marguet. Le dispositif expérimental étant basé sur un large excès de substrat, la comparaison avec

les prédictions théoriques obtenues par les équations de cinétiques classiques de Michaelis-Menten

en sera grandement simplifiée. Nous prévoyons par ailleurs d'aborder la description théorique de

l'évolution temporelle des concentrations d'enzyme, de substrat et de produits intermédiaires/finaux

d'un point de vue dynamique (plutôt que de rester purement phénoménologique à l'instar des

équation de Michaelis-Menten). En particulier, une description dynamique devrait nous permettre de

distinguer un mode purement stochastique de rencontre entre partenaires biochimiques d'une

situation hybride résultant de la superposition d'une force aléatoire (découlant des chocs chaotiques

des molécules d'eau) et d’une force électrodynamique (attractive) à longue portée. Nous pensons que

la mesure en temps réel des cinétiques enzymatiques à différentes concentrations d'enzyme/substrat

(possiblement en maintenant une concentration d'enzyme proche de celle de son substrat) et la

comparaison des résultats expérimentaux avec les courbes prédites par la théorie constituent la

meilleure approche pour répondre aux questions fondamentales énoncées ci dessus. Si tel est le cas,

notre connaissance des mécanismes de base du vivant en serait considérablement améliorée.

[1] O.G. Berg, R.B. Winter, P.H. von Hippel,

Biochemistry

20, 6929 (1981).

R.B. Winter, O.G. Berg, P.H. von Hippel,

Biochemistry

20, 6961 (1981).

T. Hu, A.Y. Grosberg, B.I. Shklovskii,

Biophys. J.

90, 2731 (2006).

M. Slutsky, L.A. Mirny,

Biophys. J.

87, 4021 (2004).

M. Slutsky, M. Kardar, L.A. Mirny,

Phys.Rev

E69, 061903 (2004).

K.V. Klenin, H. Merlitz, J. Langowski, C.-X. Wu,

Phys.Rev.Lett

. 96, 018104 (2004).

R.F. Bruinsma,

Physica A

313, 211 (2002).

[2] H. Fröhlich,

Int. J. Quantum Chem

. 2, 641 (1968).

[3] H. Fröhlich,

Phys. Lett.

A39, 153 (1972).

H. Froehlich,

Proc. Natl.Acad Sci. USA

72, 4211 (1975).

J.R. Reimers, L.K. McKemmish, R. H. McKenzie, A.E. Mark, N.S.Hush, PNAS, vol. 106, n° 11, 4219

(2009).

[4] H. Fröhlich,

Nature

228, 1093 (1970);

H. Fröhlich,

Rivista Nuovo Cimento

7, 399 (1977).

[5] U. Kettling, A. Koltermann, P. Schwille, M. Eigen,

Proc.Natl.Acad.Sci. USA

95, 1416 (1998).