Solid phase synthesis of thiazole orange labeled peptide nucleic acids for homogeneous detection of single base mutation in DNA [Elektronische Ressource] / von Dilip Venkatrao Jarikote

Dilip

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• Publié le: 01 janvier 2007
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• Langue: Deutsch
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Extrait

“Solid Phase Synthesis of Thiazole Orange Labeled
Peptide Nucleic Acids for Homogeneous Detection of
Single Base Mutation in DNA”
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
d o c t o r r e r u m n a t u r a l i u m
(Dr. rer. nat.)

im Fach Chemie
eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von M. Sc. Dilip Venkatrao Jarikote
geboren am 01.04.1977 in Digrass-Nanded, Maharashtra (INDIA)
Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. C. Markschies

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. C. Limberg
Gutachter: 1. Prof. Dr. Oliver Seitz
2. Prof. Dr. Beate Röder 3. Prof. Dr. Ronald Micura
Tag der mündlichen Prüfung:23. 02. 2007
1






























Die vorliegende Arbeit wurde im Arbeitskreis von Prof. Dr. H. Waldmann unter der
Betreuung von Dr. Oliver Seitz in der Zeit von Dezember 2002 am Institut für
Organische Chemie der Universität Dortmund und am Max-Planck-Institut für
molekulare Physiologie sowie ab Juni 2003 bis Oktober 2006 im Arbeitskreis von
Prof. Dr. Oliver Seitz am Institut für Chemie im Fachinstitut für Organische und
Bioorganische Chemie der Humboldt-Universität zu Berlin angefertigt.

































To my youngest brother Umakant.
Zusammenfassung
I. Zusammenfassung


Interkalatorfarbstoffe wie Thiazolorange (TO) wurden an Stelle einer internen
Nucleobase in PNA eingebaut. Solche Konjugate werden als FIT-Sonden (Forced
Intercalation of Thiazole Orange) bezeichnet. Bei Hybridisierung interkaliert
Thiazolorange in unmittelbarer Nachbarschaft zu einem mismatch Basenpaar in einen
PNA·DNA-Duplex (Abbildung I).


Abbildung I: Einzelstrang von PNA ( links), Aeg-FIT-PNA (mitte) und Orn-FIT-PNA (rechts).

I.I Synthese

Diese Arbeit befasste sich zunächst mit der Entwicklung einer linearen Strategie
für die Festphasensynthese von PNA. Dafür musste ein neuer Thiazolorange-
Monomer-Baustein hergestellt werden. Der neue Baustein Fmoc-Aeg(TO)-OH sowie
die rückgratmodifizierten Derivate Fmoc-L- bzw. Fmoc-D-Orn(TO)-OH wurden
mittels Kupplung von Thiazolorange-Carbonsäure mit den Fmoc/Allyl-geschützten
Bausteinen 2b und 22b synthetisiert. Die anschließende Pd(0)-katalysierte Abspaltung
der Allylgruppe ergab die gewünschten TO-Bausteine 3b und 24b mit 73% und 65%
Ausbeute (Schema I). Die neuen Monomere wurden bei der linearen
Festphasensynthese von FIT-PNA-Oligomeren wie den TO-Sonden 10 oder 38
eingesetzt. Zunächst wurde der erste Teil der Sequenz am Harz (Schema II)
aufgebaut. Bei der anspruchsvolleren Kupplung der TO-Monomere wurde PPTS
zugesetzt, um deren Löslichkeit zu erhöhen. Anschließend wurde der lineare Aufbau
des PNA-Oligos fortgesetzt.
I Zusammenfassung

Schema 1: a) TO-CH COOH (1), 2b oder 22b, PyBOP, PPTS, NMM, DMF; b) [Pd(PPh ) ], 2 3 4
, THF. PhNHCH3

Die erhaltenen TO-PNA-Konjugate wurden mittels TFA von der festen Phase
abgespalten. Der Reinheitsgrad der Rohprodukte war höher als der der auf dem Wege
der divergenten Festphasensynthese hergestellten Produkte. Nach diesem Protokoll
wurden die TO-PNA-Oligomere mit Gesamtausbeuten von 7.8-9.4% synthetisiert.


Schema 2: Lineare PNA-Synthese: a) und c) Synthesezyklus mit 1) Piperidin/DMF; 2)
Fmoc-B (Bhoc)-OH, NMM, PyBOP, DMF; 3) AcO/Pyridin, DMF; b) Synthesezyklus mit 1) 2
Piperidin/DMF; Fmoc-Aeg (TO)-OH 3b oder Fmoc-D-Orn (TO)-OH 24b, NMM, PyBOP, PPTS,
DMF; 3) Ac O/Pyridin, DMF; d) TFA, m-Kresol, H O, L-Cys-OMe. 2 2
II Zusammenfassung
I.II Nachbarschaftseffekte


Abbildung II: Untersuchte Bibliothek von A) Aeg-FIT-PNA und B) D-Orn-FIT-PNA mit perfekt
komplementärer oder einzelbasenfehlpaarender DNA.

Um den Einfluss der stacking- und pairing-Partner von Thiazolorange auf
Stabilität und optische Eigenschaften der entsprechenden PNA•DNA-Duplexe zu
untersuchen, wurden sowohl N-terminal (x) als auch C-terminal (y) benachbarte
Basen von TO in Aeg-TO- und D-Orn-TO-Oligomeren variiert. (Abbildung II)
Sechzehn verschiedene Sonden wurden mit den Oligonucleotiden 5´-20´MZN in der
Weise hybridisiert, dass TO sich gegenüber Base Z des Targetstrangs und in
unmittelbarer Nachbarschaft jedes möglichen Basenpaares befand.

Thermische Stabilität
Schmelzkurvenanalysen zeigten, dass eine GC-reiche Umgebung von TO
(T = 77°C) zu einer höheren Duplexstabilität führt als eine AT-haltige M
Nachbarschaft, in der sich TO zwischen zwei Thyminen, zwei Adeninen oder einem
Adenin und einem Thymin (T = 69 - 73°C) befindet. Perfekte (match) Duplexe M
waren stets stabiler als einzelbasenfehlgepaarte (mismatch) Duplexe. Die Daten aus
Abschnitt 2.4 belegen, dass die Hybridisierung von FIT-PNA ausnahmslos
III Zusammenfassung
sequenzselektiv ist. Aus Schmelzanalysen geht außerdem hervor, dass alle vier
Nucleobasen A, C, G und T als Paarungspartner von TO toleriert werden.
Interessanterweise ist die thermische Stabilität der Duplexe um T = 3°C höher, wenn M
sich gegenüber TO keine Nucleobase befindet verglichen mit Duplexen, in denen T
als Paarungspartner von TO fungiert. Scheinbar erfolgt die Interkalation des TO-
Farbstoffs besonders leicht, wenn die sterische Hinderung durch eine
gegenüberliegende Nucleobase reduziert ist. Wird dagegen eine zum interkalierenden
TO benachbarte Base entfernt, verringert sich die Duplexstabilität wahrscheinlich auf
Grund fehlender Stapelungswechselwirkung um 9°C.

Absorptions-Untersuchungen
Für Einzelstrang-FIT-PNAs liegt der Extinktionskoeffizent ε zwischen 16100 max
-1 -1und 59300 M cm (Abbildung III), in Doppelsträngen ist ε um 22–53 % höher. max
Die Absorption von TO sowohl in einzel- als auch in doppelsträngigen FIT-PNAs ist
stark von seiner unmittelbaren Nachbarschaft abhängig. Zum Vergleich wurde die
Bindung des freien Farbstoffs TO-PRO1 an die Komplexe DNA•DNA bzw.
PNA•DNA untersucht. Die Anlagerung an die entsprechenden Doppelstränge führt zu
einer Verringerung von ε um 23% bzw. 33%. max

0.4
14ag14ag
15gg
0.3 19gc
18ac
10aa0.2
20cc
6 at6 at
5 tt0.1
0
250250 300300 350350 400400 450450 500500 550550 600600
λλ/n/nmm

Abbildung III: Absorptionsspektren von Einzelstrang-PNA-TO-Konjugaten (5-20xy). Die Absorption
wurde entsprechend dem Wert bei 600 nm korrigiert, die Absorptionskurven wurden mit dem
berechneten Wert für ε kalibriert. 260
IV
Abssoorrption Zusammenfassung
Fluoreszenz-Studien

In Abbildung IV ist die Fluoreszenzerhöhung von Aeg-TO-PNA (grau) und D-
Orn-TO-PNA (schwarz) nach Bildung perfekter Duplexe mit komplementären
Oligonucleotiden dargestellt. TO wurde dabei mit allen vier Nucleobasen gepaart.

o = Aeg/D-Orn (TO), x; y = t, a, g und c
M, Z, N = T, A, G and C

a x Z y (F / F )ds (match) ss
29a T a 24
32a T c 20
20t T a 19
19t T t 16
16a T g 16
27a T t 14
22g a T 13
6a a G 11
2c G g 10
11a A a 9
3t G a 9
14a G c 8
10a A c 8
6a A g 8
7c T g 7
10a C a 7
3t A a 7
4t T g 6
9t T c 6
2t C t 6
3t C a 6
5g A a 6
16g T c 6
3g T t 5
9a G t 5
3t A t 5
3c A g 5
9g g T 5
a c 9C 5
10c T c 4
7g G a 4
7g C a 4
24c T a 4
11g G c 4
9a A t 4
4a C g 4
7c G a 4
V Zusammenfassung
o = Aeg/D-Orn (TO), x; y = t, a, g und c
M, Z, N = T, A, G and C

a x Z y (F / F )ds (match) ss
7t G t 4
6a C t 4
2a C g 4
7g A c 4
5g C g 3
6c G c 3