Somatic hybridisation in different Cyclamen species [Elektronische Ressource] / Anika Nadja Sabine Prange

Anika Nadja Sabine Prange

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• Publié par: gottfried_wilhelm_leibniz_universitat_hannover
• Publié le: 01 janvier 2010
• Nombre de lectures: 13
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 12 Mo

Extrait

Somatic hybridisation in different
Cyclamen species


Von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Hannover

zur Erlangung der Grades

Doktorin der Gartenbauwissenschaften
Dr. rer. hort.

genehmigte Dissertation
von

Dipl.-Biol. Anika Nadja Sabine Prange

geboren am 26. September 1980 in Waldbröl


2010




























Referentin: Prof. Dr. Traud Winkelmann

Korreferentin: Prof. Dr. Margrethe Serek

Tag der Promotion: 05. August 2010
Abstract
Cyclamen persicum Miller is an economically important ornamental plant worldwide, in
contrast to other species of the genus Cyclamen. Due to the breeding achievements
made in C. persicum and the numerous interesting and valuable traits of the other
Cyclamen species, a hybridisation of these species with resulting fertile hybrids is
desirable. Sterile seedlings of C. mirabile Hildebrand, C. coum Miller, C. graecum Link
and C. hederifolium Aiton were used as a starting material for adventitious shoot induction
on two different culture media. Shoot cultures were obtained from all species, grown to
plantlets and acclimatised to the greenhouse. Mature leaves of greenhouse-grown plants
and sterile seedlings served as the initial material for establishment of embryogenic
cultures of C. coum, C. graecum, C. mirabile and C. alpinum Schwarz. The ability to form
adventitious shoots, to form embryogenic callus and to regenerate by somatic
embryogenesis was strongly genotype-dependent for each species. Embryogenic callus
cultures exhibited a high regeneration capacity of up to 2,922 somatic embryos per gram
of fresh mass in C. mirabile. Somatic embryogenesis in some species was affected by
decreasing embryogenic capacity, browning, hyperhydricity and continuous secondary
somatic embryogenesis, but plants from all species were regenerated and acclimatised to
greenhouse conditions with high efficiency in some species (C. coum and C. mirabile).
Protoplasts were successfully isolated from adventitious shoots (C. graecum), somatic
embryos (C. coum) and embryogenic suspension cultures (C. alpinum, C. coum,
C. graecum and C. mirabile). The protoplast culture conditions were optimised regarding
embedding agents (agarose and alginate) and different concentrations of plant growth
regulators (PGRs) with the different Cyclamen species showing different culture condition
preferences. Protoplasts from adventitious shoots were not regenerated to plants,
whereas protoplasts derived from both somatic embryos and embryogenic suspension
cultures were successfully cultured in vitro, regenerated into plants by somatic
embryogenesis and acclimatised to the greenhouse. Plants regenerated from C. coum
protoplasts were analysed for somaclonal aberrations using phenotypic analyses and flow
cytometric measurements revealing the occurrence of tetraploid plants. Protoplasts of
C. coum and C. graecum were fused with protoplasts of C. persicum by applying the
technique of polyethylene glycol (PEG)-mediated protoplast fusion. Heterofusion
frequencies were detected by double fluorescent staining with fluorescein diacetate and
scopoletin. Based on these staining methods, the selection of heterofusion products using
Cell Finder Slides, Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and a microfluidic chip
was tested. The first somatic hybrids were obtained between C. persicum and C. coum
fusion combinations but not for C. persicum and C. graecum fusion combinations. Hybrid
plants were characterised by a partly intermediate phenotype with greater resemblance to
C. coum. Flow cytometric measurements revealed an additive DNA content of both
parental species in the hybrids. By the application of the developed species specific
marker and RAPD PCR (randomly amplified polymorphic DNA polymerase chain
reaction), however, the C. persicum genome was barely detected indicating aneuploidy or
chromosome recombination in the hybrid plants.

(key words: Cyclamen, somatic embryogenesis, protoplast fusion, molecular marker)


Kurzfassung
Cyclamen persicum Miller ist im Gegensatz zu anderen Arten der Gattung Cyclamen
weltweit eine wirtschaftlich bedeutende Zierpflanze. In Anbetracht der Züchtungserfolge in
C. persicum und den zahlreichen interessanten und wertvollen Eigenschaften der anderen
Cyclamen Arten ist eine Hybridisierung dieser Arten mit resultierenden fruchtbaren
Hybriden wünschenswert. Sterile Sämlinge von C. mirabile Hildebrand, C. coum Müller,
C. graecum Link und C. hederifolium Aiton wurden als Ausgangsmaterial für die Induktion
von Adventivsprossen auf zwei verschiedenen Kulturmedien verwendet. Adventivsprosse
wurden bei allen Arten erhalten, zu Pflanzen angezogen und ins Gewächshaus überführt.
Blätter von Gewächshauspflanzen und sterilen Sämlingen dienten als Ausgangsmaterial
für die Etablierung von embryogenen Kulturen von C. coum, C. graecum, C. mirabile und
C. alpinum Schwarz. Die Fähigkeit Adventivsprosse und embryogenen Kallus zu bilden
und durch somatische Embryogenese zu regenerieren war für jede Art stark Genotyp
abhängig. Embryogene Kalluskulturen verfügten über eine hohe Regenerationsfähigkeit
von bis zu 2922 somatischen Embryonen pro Gramm Frischmasse in C. mirabile. Die
Entwicklung der somatischen Embryonen war in einigen Arten beeinträchtigt durch die
Abnahme der Fähigkeit Embryonen zu bilden, Verbräunung, Hyperhydritzität und durch
anhaltende sekundäre Embryogenese. Dennoch wurden bei allen Arten Pflanzen
regeneriert und ins Gewächshaus überführt; bei einigen Arten mit sehr hoher Effizienz
(C. coum und C. mirabile). Protoplasten wurden erfolgreich aus Adventivsprossen
(C. graecum), aus somatischen Embryonen (C. coum) und embryogenen Suspensions-
kulturen (C. alpinum, C. coum, C. graecum und C. mirabile) isoliert. Die Kultur-
bedingungen der Protoplasten wurden bezüglich der Einbettungsmedien (Agarose und
Alginat) und verschiedenen Konzentrationen von pflanzlichen Wachstumsregulatoren mit
den verschiedenen Cyclamen Arten optimiert, wobei die verschiedenen Cyclamen Arten
unterschiedliche Wachstumsbedingungen bevorzugten. Protoplasten von Adventiv-
sprossen wurden nicht zu Pflanzen regeneriert. Sowohl aus somatischen Embryonen als
auch aus embryogenen Suspensionskulturen isolierte Protoplasten wurden erfolgreich in
vitro kultiviert, zu Pflanzen regeneriert und ins Gewächshaus überführt. Aus C. coum
Protoplasten regenerierte Pflanzen wurden mittels phänotypischer Untersuchungen und
durchflusszytometrischer Messungen auf somaklonale Variation untersucht, die das
Vorhandensein von tetraploiden Pflanzen zeigten. Protoplasten von C. coum und
C. graecum wurden mit Protoplasten von C. persicum mit Hilfe der Polyethylen-Glykol
(PEG) vermittelten Protoplasten-Fusion fusioniert. Heterofusionsfrequenzen wurden durch
die doppelte Fluoreszenzfärbung mit Fluoresceindiacetat und Scopoletin detektiert.
Basierend auf diesen Färbemethoden, wurde die Selektion von Heterofusionsprodukten
mittels „Cell Finder Slides“, „Fluorescence Activated Cell Sorting“ (FACS) und mikro-
fluidischen Chips geprüft. Erstmalig wurden somatische Hybriden aus C. persicum und
C. coum Fusionen erhalten, jedoch nicht aus Fusionen von C. persicum und C. graecum.
Hybride Pflanzen zeigten einen teils intermediären Phänotyp, mit größerer Ähnlichkeit zu
C. coum. Die durchflusszytometrischen Messungen zeigten einen addierten DNA-Gehalt
von beiden elterlichen Arten in den Hybriden. Bei der Anwendung der entwickelten Art-
spezifischen Marker und der RAPD PCR, war das C. persicum Genom nur schwer
nachweisbar, was auf Aneuploidie oder Chromosomen-Rekombination in den hybriden
Pflanzen hinweist.

(Schlüsselwörter: Cyclamen, somatische Embryogenese, Protoplastenfusion, molekularer
Marker) I

TABLE OF CONTENTS I

List of abbreviations IV
List of tables VI
List of figures VII

1 Introduction .................................................................................... 1
1.1 The genus Cyclamen ............................................................. 1
1.1.1 Morphology ................................................................................................. 1
1.1.2 Taxonomy............................................ 2
1.1.3 Distribution, Habitat and Phenological Adaption ......................................... 3
1.2 Cyclamen persicum Miller ...................................................................................... 5
1.2.1 Cultivation................................................................... 5
1.2.2 Breeding ..................................................................................................... 6
1.2.3 Tissue Culture .................................................................... 7
1.2.3.1 Organogenesis ................