Structural basis for the cooperation of Hsp110 and Hsp70 molecular chaperones in protein folding [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Sigrun Polier

Sigrun Polier

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• Publié par: ludwig-maximilians-universitat_munchen
• Publié le: 01 janvier 2009
• Nombre de lectures: 16
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 6 Mo

Extrait

Ludwig-Maximilians-Universität München
Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried





Structural Basis for the Cooperation of Hsp110 and Hsp70
Molecular Chaperones in Protein Folding




Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades
der Fakultät für Chemie und Pharmazie
der Ludwig-Maximilians-Universität München






vorgelegt von
Sigrun Polier
aus Höxter

2009

Erklärung
Diese Dissertation wurde im Sinne von §13 Absatz 3 der Promotionsordnung vom
29. Januar 1998 von Herrn Prof. F. Ulrich Hartl betreut.



Ehrenwörtliche Versicherung
Diese Dissertation wurde selbständig, ohne unerlaubte Hilfsmittel erarbeitet.

München, am



















Dissertation eingereicht am 20. März 2009
1. Gutachter Prof. Dr. F. Ulrich Hartl
2. Gutachter Prof. Dr. R. Beckmann
Mündliche Prüfung am 18. Mai 2009
DANKSAGUNG

Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von September 2006 bis März 2009 in der
Abteilung Zelluläre Biochemie des Max-Planck-Instituts für Biochemie in Martinsried
angefertigt.

Mein besonderer Dank gilt Prof. Dr. F. Ulrich Hartl für die Bereitstellung des überaus
interessanten Themas sowie herausragender Arbeitsbedingungen. In zahlreichen
Diskussionen habe ich seine bewundernswert geradlinige und logische
Herangehensweise an wissenschaftliche Fragestellungen erfahren dürfen.

Nicht weniger herzlich möchte ich mich bei Dr. Andreas Bracher bedanken, unter
dessen hervorragender Betreuung diese Arbeit erstellt wurde. Sein breiter theoretischer
Hintergrund, seine experimentellen Fähigkeiten sowie seine unermüdliche Geduld
haben maßgeblich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen. Die vielen
spannungsgeladenen Stunden am Synchrotron werden mir genauso wie die mitunter
hitzigen Debatten zu mitternächtlicher Stunde unvergesslich bleiben.

Darüber hinaus bin ich Dr. Manajit Hayer-Hartl zu großem Dank verpflichtet, die mich
mit ihrer Frohnatur und experimentellem Geschick besonders beim Luciferaseassay
unterstützt hat. Dr. Zdravko Dragovic danke ich für die Einführung in die Stopped
Flow Technik. Bei allen Mitarbeitern der Abteilung Zelluläre Biochemie bedanke ich
mich für die äußerst konstruktive Zusammenarbeit und die wirklich angenehme
Arbeitsatmosphäre. Besonders hervorheben möchte ich dabei neben den Badminton-
und Tennisspielern auch die Teilnehmer am Sprachtandem sowie die
Abteilungsmasseurin. Den Mitgliedern des Lunch-Clubs danke ich für die angeregten
mittäglichen Unterhaltungen über Wissenschaft und vieles mehr.

Christian danke ich von ganzem Herzen. Er hat mir in den letzten Monaten durch sein
liebevolles, ausgleichendes Wesen sehr geholfen.

Mein herzlichster Dank gilt Mutter, Astrid und Gernot, die mich weit über die
Promotion hinaus stets unterstützen, besonders indem sie mir ein sehr geborgenes
familiäres Umfeld bereiten. Ihnen möchte ich diese Arbeit widmen.

Table of Contents I

TABLE OF CONTENTS

1 Summary ............................................................................................................................. 1
2 Introduction ........................................................................................................................ 3
2.1 The protein folding problem ....................................................................................... 3
2.2 Protein aggregation in vivo ......................................................................................... 5
2.3 Molecular chaperones ................................................................................................. 9
2.4 The chaperonin, Hsp90 and Hsp100 systems ........................................................... 12
2.5 The Hsp70 system .................................................................................................... 16
2.5.1 Structure and reaction cycle of Hsp70 .................................................................. 16
2.5.2 Hsp40 cochaperones induce the ATPase activity of Hsp70 ................................. 19
2.5.3 Hsp70 nucleotide exchange .................................................................................. 21
2.5.4 GrpE ..................................................................................................................... 23
2.5.5 BAG domain proteins ........................................................................................... 24
2.5.6 HspBP1 homologs ................................................................................................ 26
2.5.7 Hsp110 homologs ................................................................................................. 28
2.6 Aim of the study ....................................................................................................... 32
3 Materials and Methods ..................................................................................................... 34
3.1 Chemicals and biochemicals .................................................................................... 34
3.2 Antibodies ................................................................................................................. 36
3.3 Strains ....................................................................................................................... 37
3.4 Media and buffers38
3.4.1 Media .................................................................................................................... 38
3.4.2 Buffers and standard solutions ............................................................................. 40
3.5 Materials and Instruments ........................................................................................ 46
3.6 Molecular biological methods .................................................................................. 48
3.6.1 DNA analytical methods ...................................................................................... 48
3.6.1.1 DNA quantification ...................................................................................... 48
3.6.1.2 Agarose gel electrophoresis .......................................................................... 48
3.6.1.3 DNA sequencing .......................................................................................... 49
3.6.2 Purification of DNA fragments and plasmid DNA .............................................. 49
3.6.3 Cloning strategies ................................................................................................. 49
3.6.4 Polymerase chain reaction .................................................................................... 50
3.6.5 Restriction digest and DNA ligation .................................................................... 52 Table of Contents II

3.6.6 Site-directed mutagenesis ..................................................................................... 52
3.6.7 Preparation and transformation of competent E. coli cells ................................... 53
3.6.7.1 Chemocompetent E. coli cells and chemical transformation ....................... 53
3.6.7.2 Electrocompetent E. coli cells and electroporation ...................................... 53
3.6.8 Lithiumacetate transformation of S. cerevisiae cells ............................................ 54
3.6.9 Construction of sse1 mutant S. cerevisiae strains ................................................ 55
3.6.10 Isolation of chromosomal DNA from S. cerevisiae ............................................. 56
3.7 Protein biochemical and biophysical methods ......................................................... 56
3.7.1 Protein expression and purification ...................................................................... 56
3.7.1.1 Hsp110 homologs ......................................................................................... 56
3.7.1.2 Hsp70 homologs ........................................................................................... 58
3.7.1.3 Ydj1p ............................................................................................................ 60
3.7.1.4 Selenomethionine-derivatized proteins ........................................................ 61
3.7.2 Protein analytical methods ................................................................................... 62
3.7.2.1 Protein quantification62
3.7.2.2 SDS-PAGE ................................................................................................... 62
3.7.2.3 Western blotting63
3.7.2.4 TCA precipitation ......................................................................................... 63
3.7.2.5 Edman degradation ....................................................................................... 64
3.7.2.6 Mass spectrometry ........................................................................................ 64
3.7.2.7 FFF-MALS64
3.7.2.8 Circular dichroism spectroscopy ..........