Structure-function relationships of bacterial sialate O-acetyltransferases [Elektronische Ressource] / von Anne Katrin Bergfeld

Anne Katrin Bergfeld

Sujets

• Biologie
• Gesundheit

Informations

• Publié par: gottfried_wilhelm_leibniz_universitat_hannover
• Publié le: 01 janvier 2009
• Nombre de lectures: 35
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 13 Mo

Extrait

Structure-function relationships of
bacterial sialate O-acetyltransferases



Von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Hannover
zur Erlangung des Grades einer


Doktorin der Naturwissenschaften
Dr. rer. nat.




genehmigte Dissertation
von
Dipl.-Biochem. Anne Katrin Bergfeld
geboren am 16. Dezember 1980 in Bergisch Gladbach


2009
Referentin: Prof. Dr. Rita Gerardy-Schahn

Korreferent: Prof. Dr. Walter Müller

Tag der Promotion: 24. Juni 2009















































Schlagworte: Polysialinsäure, O-Acetyltransferasen, bakterielle Kapselpolysaccharide

keywords: polysialic acid, O-acetyltransferases, bacterial capsular polysaccharides






Erklärung zur Dissertation

Hierdurch erkläre ich, dass die Dissertation „Structure-function relationships of bacterial
sialate O-acetyltransferases“ selbstständig verfasst und alle benutzten Hilfsmittel sowie evtl.
zur Hilfeleistung herangezogene Institutionen vollständig angegeben wurden.

Die Dissertation wurde nicht schon als Diplom- oder ähnliche Prüfungsarbeit verwendet.




Dissertation Anne K. Bergfeld Table of Contents


Table of Contents

Zusammenfassung ………………………………………………………………………………...1

Abstract ………………………………………………………………………………………………2

Chapter 1 - General Introduction …………………………………………………………….3

1.1 - Bacterial capsular polysaccharides …………………………………………….3
1.2 - Polysialic acid capsules ………………………………………………………….5
1.3 - Genetic basis of capsule O-acetylation in Escherichia coli K1 ………...…...8
1.4 - Genetic basis of polySia O-acetylation in Neisseria meningitidis ………….11
1.5 - Objectives ………………………………………………………………………...15

Chapter 2 - Biochemical characterization of the polysialic acid-specific
O-acetyltransferase NeuO of Escherichia coli K1 ……………………….16

Chapter 3 - O-acetyltransferase gene neuO is segregated according to
phylogenetic background and contributes to environmental
desiccation resistance in Escherichia coli K1 ……………………………32

Chapter 4 - The polysialic acid specific O-acetyltransferase OatC from
Neisseria meningitidis serogroup C evolved apart from other
bacterial sialate O-acetyltransferases ……………………………………...58

Chapter 5 - Crystallization of the polysialic acid specific O-acetyltransferase
OatC from Neisseria meningitidis serogroup C …………………………..73

5.1 - Introduction ……………………………………………………………………..73
5.2 - Materials and Methods ……………………………………………………….75
5.3 - Results …………………………………………………………………………..79
5.3.1 - Purification of OatC …………………………………………………………...79
5.3.2 - Crystallization of (His) -tagged OatC ………………………………………...80 6
5.3.3 - Refinement of initial hit conditions …………………………………………...82
5.3.4 - Crystallization trials with (His) -tagged OatC at 4°C ……………………...83 6
5.3.5 - Crystallization trials with (His) -tagged OatC in the presence 6
of the donor substrate acetyl-coenzyme A ………………………………...84
5.3.6 - Influences of N-terminal and C-terminal truncations on the
structural integrity of OatC …………………………………………………...85
5.3.7 - Purification of OatC after proteolytic cleavage of the
C-terminal (His) -tag …………………………………………………………...87 6
5.3.8 - Crystallization trials with untagged OatC …………………………………...89
5.3.9 - Refinement of initial hit conditions of untagged OatC ……………………...90
5.4 - Discussion ……………………………………………………………………..92

Chapter 6 - General Discussion ……………………………………………………………96

6.1 - The sialate O-acetyltransferase NeuO is a member of the
left-handed β-helix family of acyltransferases ……………………………….97
6.2 - The capsule O-acetyltransferase OatC belongs to the
……………………………………………………...100 α/β-hydrolase fold family
6.3 - Outlook …………………………………………………………………………105

Chapter 7 - References ……………………………………………………………………106

Appendix 1 - Abbreviations ………………………………………………………………….118

Appendix 2 - Curriculum Vitae and Publications ……………………………………….119

Appendix 3 - Danksagung ………………………………………………………………….122

Page i
Dissertation Anne K. Bergfeld Zusammenfassung


Zusammenfassung

Die Sepsis- und Meningitis-Erreger Escherichia coli K1 und Neisseria meningitidis
Serogruppe C sind von einer dicken Polysaccharid-Kapsel umgeben. Die Kapselpoly-
saccharide bestehen aus α2,8- bzw. α2,9-verknüpfter Polysialinsäure (PolySia) und stellen
für beide Pathogene einen wichtigen Virulenzfaktor dar. In fast 90% aller Serogruppe C
Stämme ist die Kapsel zusätzlich durch O-Acetylierung an Position C7 oder C8 der Sialin-
säure modifiziert. Das Gen, welches die entsprechende O-Acetyltransferase OatC kodiert, ist
Teil des Kapselgenkomplexes und weist keinerlei Sequenzhomologie zu anderen Proteinen
auf. In Escherichia coli K1 wird eine phasenvariable O-Acetylierung des Kapselpoly-
saccharids an den Positionen C7 und C9 der Sialinsäuren beobachtet, die durch das
Prophagen-kodierte Enzym NeuO katalysiert wird. Die Phasenvariation wird durch eine
variable Anzahl an Heptanukleotid-Sequenzwiederholungen im 5’-Bereich des neuO-Gens
vermittelt, wobei ausschließlich Wiederholungen, die ein Vielfaches von drei sind, eine
vollständige Translation des Enzyms erlauben. Um die O-Acetylierung von PolySia-Kapseln
biochemisch zu untersuchen, wurden NeuO und OatC rekombinant exprimiert, gereinigt und
anschließend enzymatisch und strukturell charakterisiert. Im Falle von NeuO erfolgte dies
vergleichend für vier Enzymvarianten, die durch Allele mit 0, 12, 24 bzw. 36 Heptanukleotid-
Sequenzwiederholungen kodiert werden. Alle Varianten bildeten Hexamere, waren
enzymatisch aktiv und wiesen eine hohe Substratspezifität für PolySia mit >14 Resten auf.
Für die katalytische Effizienz wurde eine lineare Korrelation mit der Zahl der Sequenzwieder-
holungen beobachtet und somit ein neuartiger Mechanismus zur Modulation der NeuO-
Aktivität aufgedeckt. Mit Hilfe eines Strukturmodells und der Identifizierung von zwei
konservierten Aminosäuren, die kritisch für die enzymatische Aktivität sind (His-119 und Trp-
143), konnten deutliche Übereinstimmungen zur Hexapeptidrepeat-Proteinfamilie aufgezeigt
werden. Im Gegensatz zu NeuO wurde OatC als Homodimer gefunden, wobei die ersten 34
Aminosäuren eine effiziente Oligomerisierungsdomäne ausbilden, deren Funktion auch in
einem anderen Proteinkontext erhalten blieb. Die Suche nach Sequenzmotiven führte zur
286Identifikation eines nucleophile elbow-Motivs (GXS XGG), welches ein Charakteristikum
der α/β-Hydrolase fold-Enzyme ist. Mittels umfangreicher Mutagenese-Experimente konnte
eine katalytische Triade identifiziert werden, die aus Ser-286, Asp-376 und His-399 besteht.
In Übereinstimmung mit einem für α/β-Hydrolase fold-Enzyme typischen Ping-Pong-
Mechanismus, wurde die Bildung eines kovalenten Acetyl-Enzym-Intermediats nachge-
wiesen. Zusammen mit Sekundärstrukturanalysen, die eine α/β-Hydrolase fold-Topologie
vorhersagen, liefern die gezeigten Daten klare Hinweise, dass OatC zur α/β-Hydrolase fold-
Familie gehört. Dies zeigt, dass OatC evolutionär unabhängig von allen anderen bakteriellen
Sialinsäure-spezifischen O-Acetyltransferasen entstanden ist. Diesen gemeinsam ist die
Zugehörigkeit zur Hexapeptidrepeat-Proteinfamilie, einer Gruppe von Acyltransferasen, die
durch eine linksgängige β-Helix und die Ausbildung katalytischer Trimere gekennzeichnet
sind. In ersten Kristallisations-Experimenten zur Aufklärung der 3D-Strukturen von PolySia-
spezifischen O-Acetyltransferasen wurden OatC-Kristalle erhalten, die die Streuung von
Röntgenstrahlen bis zu einer Auflösung von etwa 3,8 Å ermöglichten.
Page 1
Dissertation Anne K. Bergfeld Abstract


Abstract

Escherichia coli K1 and Neisseria meningitidis serogroup C are protected by thick
polysaccharide capsules composed of α2,8- and α2,9-linked polysialic acid (polySia),
respectively. Both pathogens cause bacterial sepsis and meningitis and their capsules
represent major virulence factors. In the majority of the serogroup C strains, the capsular
polysaccharide is further modified by O-acetylation at C7 or C8 of the sialic acids. The gene
encoding the corresponding O-acetyltransferase OatC is part of the capsule gene complex
and shares no sequence similarities with other proteins. In Escherichia coli K1, capsule O-
acetylation at position C7 and C9 of the sialic acids is a phase-variable modification that is
catalyzed by the prophage-encoded O-acetyltransferase NeuO. Phase-variation is mediated
by changes in the number of heptanucleotide repeats within the 5’-region of neu