The role of the pro-inflammatory cytokine Interleukin-18, its processing enzyme Caspase-1, and potential alternative IL-18-activating pathways in atherosclerosis [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Norbert Gerdes

Norbert Alter

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• Publié le: 01 janvier 2005
• Nombre de lectures: 12
• Langue: English
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Extrait

The role of the pro-inflammatory cytokine
Interleukin-18, its processing enzyme
Caspase-1, and potential alternative IL-18-
activating pathways in atherosclerosis


Inaugural-Dissertation

zur

Erlangung des Doktorgrades

der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

der Universität zu Köln


vorgelegt von
Norbert Gerdes
aus Altenberge


Köln 2005




This work was performed between September 2001 and May 2005 under supervision of
Professor Dr. Uwe Schönbeck in the group of Professor Dr. Peter Libby at the Division of
Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Brigham & Women’s Hospital and
Harvard Medical School in Boston, Massachusetts, United States of America. The work was
mentored by Professor Dr. Helmut W. Klein, Institute for Biochemistry, University of
Cologne, Germany.












Referees (Berichterstatter): Prof. Dr. Helmut W. Klein, University of Cologne
Prof. Dr. Jens Brüning, University of Cologne
Prof. Dr. Uwe Schönbeck, Harvard Medical School

Day of disputation: 5. July 2005



























For Christin

And

My family




Table of contents


Table of Abbreviations ….…………………………….……….…………………….... 5
Zusammenfassung (German summary) ……………………………………………….. 7
Summary………………………………………………………………………………. 8
1. Introduction ……………………………………...……………………..…………... 9
1.1. Cardiovascular disease and atherosclerosis……………………....………. 9
1.2. Atherosclerosis: An inflammatory disease ……………………....…….… 10
1.3. Matrix metalloproteinases in atherosclerosis…………………………….. 14
1.4. Cytokines in atherosclerosis ……………………………………………... 15
1.5. The pro-inflammatory cytokine IL-18….……………………....………... 16
1.6. Caspase-1………………………………………………………………... 17
1.7. IL-18 and atherosclerosis…………………….……………………....….. 18
1.8. Clinical association of IL-18 with cardiovascular disease and its risk factors... 20
1.9. Aim of this thesis ………………………………………………………... 21
2. Materials and Methods ………………….…………………...………..…………... 22
2.1. Materials ………………….……………………………………………... 22
2.2. Expression of IFNγ in atheroma-associated cell types ………....……….. 22
2.3. Murine atherosclerosis model……………………………………………. 30
2.4. Western blot analysis of mouse tissue lysates…………………………… 40
2.5. MMP-mediated processing of proIL-18…………………………….....… 42
3. Results …………………………………………………………………………….. 45
3.1. IL-18 induces IFNγ in macrophages and smooth muscle cells..………… 45
3.2. Deficiency of IL-18 decreases development of atherosclerosis in mice.... 51
3.3. The role of IL-18R in atherogenesis……………………………………... 65
3.4. Caspase-1 deficiency does not limit atherogenesis in hyperlipidemic mice.... 71
3.5. Caspase-1 independent processing of proIL-18……………………………. 78
4. Discussion …………………………………………………………………….…… 90
5. References ………………………………………………………………….….…... 103
Acknowledgments ......………………...……….…………………………………….. 118
Statement of Research ….………………………………………………………..…... 120
Curriculum vitae......………………...……….……………………………………….. 122


PhD Thesis - 4- Norbert Gerdes Table of Abbreviations

APMA p-aminophenylmercuric acetate
ApoE Apolipoprotein E
-/-apoe ApoE-deficient (mouse)
bp Base pair
BCA Bicinchoninic Acid
BMI Body mass index
BMT Bone marrow transplantation
BSA Bovine serum albumin
CAD Coronary artery disease
Caspase Cysteine aspartate protease
-/- casp1 Caspase-1-deficient (mouse)
CD Cluster of differentiation
CRP C-Reactive protein
CO Carbon dioxide 2
CVD Cardiovascular disease
DMEM Dulbecco’s modified eagle medium
DNA Deoxyribonucleic acid
dNTP Deoxynucleotide triphosphate
DTT Dithiothreitol
EC Endothelial cells
ECGF Ecell growth factor
ECM Extracellular matrix
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
FACS Fluorescence activated cell sorting
FBS Fetal bovine serum
FITC Fluorescein isothiocyanate
GAPDH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
GM-CSF Granulocyte/macrophage-colony stimulating factor
Gy Gray (SI unit for radiation dose; 1 Gy = 1 J / kg = 100 Rad
HBSS Hanks’ balanced salt solution
HCD High cholesterol diet
HRP Horse radish peroxidase
ICAM-1 Intercellular adhesion molecule 1
ICE Interleukin-1β-converting enzyme (= Caspase-1)
IGIF Interferon gamma-inducing factor
IFNγ Interferon gamma
IgG Immunoglobulin class G
IHC Ihistochemistry
IL Interleukin
IL-1β Interleukin-1 beta
IL-18BP Interleukin-18 binding protein
IL-1RacPL Interleukin-1 receptor accessory protein-like
IL-1Rrp Interlrr related protein
IL-18R Interleukin-18 receptor
-/- il1r1 Interleukin-1 rr type 1-deficient (mouse)
-/- il18r1 Interleukin-18 receptor alpha-deficient (mouse)
ISH In situ hybridization
JNK c-Jun N-terminal kinase

PhD Thesis - 5- Norbert Gerdes IRAK Interleukin receptor associated kinase
LC-MS/MS Liquid chromatography mass
spectrometry/mass spectrometry
LPS Lipopolysaccharide (= endotoxin)
kb Kilo base
kDa Kilo dalton
LDL Low density lipoprotein
LDLR LDL receptor
MAPK Mitogen-activated protein kinase
MCP-1 Monocyte chemoattractant protein 1
MHC I Major histocompatibility complex class I
MIP-1 Macrophage inflammatory protein 1
MMP Matrix metalloproteinase
MØ Mononuclear phagocytes, Macrophage
M-CSF Macrophage colony-stimulating factor
MI Myocardial infarction
MyD88 Myeloid differentiation primary response gene 88
NFκB Nuclear factor kappa B
NK cells Natural killer cells
PBS Phosphate-buffered-saline
PDGF Platelet-derived growth factor
PE Phycoerythrin
PMSF Phenylmethylsulfonyl fluoride
pNA p-Nitroaniline
PR-3 Proteinase-3
proIL-1/proIL-18 IL-1/ IL-18 precursor
(m)RNA (messenger) Ribonucleic acid
RPMI Rockwell park memorial institute
RT-PCR Reverse transcriptase-polymerase chain reaction
SCID Severe combined immuno deficiency
SD Standard deviation
SDS-PAGE Sodium-dodecylsulfate-polyacrylamide
gelelectrophoresis
SEM Standard error of the mean
SMC Smooth muscle cells
STAT5 Signal transducer and activator of transcription factor 5
TAE Tris-acetate-EDTA
TF Tissue factor
TGFβ Transforming growth factor beta
T T helper (lymphocytes) H
TMB Tetramethylbenzidine
TNFα Tumor necrosis factor alpha
TNFR TNF receptor
TIMP Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases
TFPI-2 Tfactor pathway inhibitor-2
TRAF TNF Receptor Associated Factor
UV Ultraviolet
VCAM-1 Vascular cell adhesion molecule 1

PhD Thesis - 6- Norbert Gerdes Zusammenfassung
Die Arteriosklerose mit ihren klinischen Komplikationen ist eine der häufigsten
Todesursachen in den westlichen Industrienationen. Abstandnehmend vom klassischen
Verständnis als Erkrankung des Fettstoffwechsels mit konsekutiver Einlagerung von Lipiden
in der Gefäßwand und hierdurch provozierten mechanischen Komplikationen, geht man
heute vielmehr von einem komplexen dynamischen Krankheitsbild aus. Dabei sind
insbesondere inflammatorische und immunologische Prozesse von entscheidender
pathophysiologischer Bedeutung. In der Tat beinhalten arteriosklerotische Läsionen eine
Vielzahl immunologisch aktiver Zellen. Diese produzieren verschiedenste
proinflammatorische Mediatoren, welche ihrerseits die Atherogenese unterhalten und
letztlich zum Auftreten klinischer Symtome führen, wie etwa der instabilen Angina, des
Mykardinfarktes oder des Schlaganfalls. Unlängst konnten wir das proinflammatorische
Zytokin Interleukin-18 (IL-18) als neuen, potentiellen Mediator der Arteriosklerose
identifizieren.
Auf diesen Ergebnissen aufbauend besteht das Ziel der vorliegenden Arbeit darin, die
in vivo Rolle von IL-18 und seiner aktivierenden Protease Caspase-1 in der Arteriosklerose
am Mausmodell zu evaluieren. Interressanterweise führte die IL-18-Defizienz zu einer
signifikanten Reduktion früher arteriosklerotischer Läsionen, während spätere Stadien der
Erkrankung unbeeinflusst blieben. Diese Studien verdeutlichen, dass IL-18 über seine
klassiche Funktion, der Induktion von Interferon- γ (INF-γ), hinausgehend von
pathophysiologischer Bedeutung für die Progression der Arteriosklerose ist. Weiterführende
Experimente an durch Knochenmarktransplantation erhaltenen chimären Mäusen mit IL-
18R α defizienten hämatopoetischen bzw. vaskuläre Zellen ergaben, dass die proatherogenen
Effekte von IL-18 nicht über den IL-18R α vermittelt werden. Ferner vermochte die Caspase-
1 Defizienz überraschender Weise nicht die Atherogenese zu beeinflussen, ein Ergebnis,
welches alternative Mechanismen der IL-18 Aktivierung nahelegte. Im Folgenden
durchgeführte Experimente untersuchten, ob Matrixmetal