Transcriptional regulation of MAD1 expression by TGFbeta1 [Elektronische Ressource] / Nadine Hein

Hein Nadine

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• Publié le: 01 janvier 2011
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Extrait

Transcriptional regulation of MAD1 expression
by TGF β1



Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften
der RWTH Aachen University zur Erlangung des akademischen Grades einer
Doktorin der Naturwissenschaften genehmigte Dissertation


vorgelegt von

Diplom-Biologin
Nadine Hein
aus Bückeburg


Berichter: Universitätsprofessor Dr. rer. nat. Bernhard Lüscher
Universitätsprofessor Dr. rer. nat. Lothar Elling


Tag der mündlichen Prüfung: 23. Februar 2010




Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online
verfügbar.
Zusammenfassung
Das bHLHZip Protein MAD1 gehört zum MYC/MAX/MAD Netzwerk von
Transkriptionsfaktoren. Dieses Netzwerk spielt eine zentrale Rolle bei der Regulation
verschiedener Aspekte der Zellphysiologie. MAD1 bindet mit seinem obligatorischen
Heterodimerisierung Partner MAX an E-Box Konsensus-Motive und reprimiert die
Transkription von Zielgenen. Diese transkriptionelle Repression basiert auf der Rekruitierung
des mSin3 Ko-Repressor-Komplex und antagonisiert zum Teil die Funktion des
Onkoproteins c-MYC. Die Expression der MAD Gene koreliert im Algemeinen mit
Differenzierungprozessen und dem Verlassen des Zellzyklus. Des Weiteren ist MAD1 an der
Induktion von Seneszenz beteiligt und hemmt die Apoptose. Diese Funktionen stehen im
Einklang mit dem Phänotyp, der in mad1 knock out Mäuse beobachtet wurde. Neutrophile
-/-Vorläuferzellen in mad1 Mäuse zeigen beschleunigte Zelteilungen vor der terminalen
Differenzierung und terminal ausdifferenzierte Zellen sind sensitiver gegenüber Apoptose
induzierenden Bedingungen.……………...………………………………..…………………………
In der vorliegenden Studie wurde die Regulation der Expression des MAD1 Gens nach
TGFβ1 Stimulation in der Promyelozyten Zelllinie U937 untersucht. Die Analyse TGFβ1
assoziierter Signalwege zeigte eine kritische Rolle der MAP-Kinase p38. Die Aktivierung
dieser Kinase ist essentiell aber nicht allein ausreichend für die TGFβ1 oder durch zellulären
Stress vermittelte MAD1 Promotor Aktivierung. Für die effiziente Indu ktion der MAD1
Expression sind zusätzliche Signale erforderlich.
Der MAD1 Promoter ist ein CpG-Insel-Promotor ohne TATA-Box und besitzt eine Region
hoher Sequenzhomologie, die durch eine offene Chromatinstruktur gekennzeichnet ist. Der
proximale Promotor besitzt mehrere Transkriptionsfaktor Bindungsmotive, darunter zwei
CCAAT- und GC -Boxen und ein E-Box-Element. Die Transkriptionsfaktoren der C/EBP
Familien, C/EBPα und C/EBPβ sind konstitutiv am Promotor gebunden und aktivieren
Reportergene, die vom proximalen MAD1 Promotor kontroliert werden. In in-vitro
Experimenten konnte gezeigt werden, dass C/EBPα und C/EBPβ als Heterodimer an die
CCAAT-Box 1 binden. Allerdings sind beide CCAAT-Boxen für die C/EBPβ abhängige
Aktivierung des MAD1 Promoters relevant. Ausserdem konnte gezeigt werden, dass C/EBPβ
und SP1, ein GC-Box bindender Transkriptionsfaktor, in der Aktivierung des MAD1
Promoters kooperieren, abhängig von jeweils einer CCAAT- und einer GC-Box. Ähnlich wie
C/EBPα und C/EBPβ, ist SP1 konstitutiv am MAD1 Promoter gebunden. Des Weiteren
konnte beobachtet werden, dass C/EBPα und SMAD3 in der Aktivierung des MAD1
Promotors zusammenwirken, während andere SMAD Proteine in der Promoter-Aktivierung
keine Rolle spielen. Dies lässt darauf schliessen, dass nicht-konventionelle TGFβ1
Signalwege an der Regulation der MAD1 Expression beteiligt sind. Ein weiterer Faktor, der
konstitutiv am MAD1 Promoter gebunden ist c -MYC. Die Analyse der funktionellen
I Bedeutung von c-MYC für die MAD1 Expression zeigte, dass c-MYC als Repressor der
C/EBPβ induzierten Aktivierung des MAD1 Promotors fungiert. Beide Faktoren interagieren
in-vivo, wobei c-MYC die Bindung des C/EBPα - C/EBPβ Heterodimers an die CCAAT-box 1
beeinträchtigt. Zusätzlich zu den konstitutiv gebunden Sequenz-spezifischen
Transkriptionsfaktoren, ist der MAD1 Promoter durch den RNA Polymerase II (Pol II)
Komplex gebunden und trägt Histonemodifikation, die mit aktiver Transkription assoziiert
sind, unter anderem ist Histone H3 trimethyliert an Lysin K4 und stark acetyliert. Sowohl die
Bindung des Pol II Komplexes an den MAD1 Promoter, als auch das
Histonesmodifikationsmuster wurden durch TGFβ1 Stimulation nicht beeinflusst. Allerdings
konnte gezeigt werden, dass die TGFβ1 Stimulation einen Wechsel in der Phosphorylierung
der Pol II C-terminale Domäne von Serin-5 zu Serin-2 initiiert. Diese Änderung ist in der
Regel mit einem Wechsel von der Initiation zur produktiven Elongation der Pol II assoziiert.
Übereinstimmend mit diesem Befund konnte nach TGFβ1 Stimulation die elongierende Pol II
innerhalb des MAD1 Gens detektiert werden. Zusammenfassend legen diese Ergebnisse
nahe, dass der MAD1 Promotor in einem voraktivierten Zustand vorliegt, der eine schnelle
Aktivierung und Initiation der Transkription des MAD1 Gens in Reaktion auf verschiedene
Signale ermöglicht.
















II Abstract
The bHLHZip protein MAD1 belongs to the MYC/MAX/MAD network of transcriptional
regulators. This network plays a pivotal role in the regulation of different aspects of cell
physiology. MAD1 binds with its obligatory heterodimerization partner MAX to E-box motifs
and represses target gene transcription. This transcriptional repression bases on the
recruitment of the mSin3 co-repressor complex and antagonizes at last in part the function of
the oncoprotein c-MYC. The expression of MAD genes generaly corelates with
differentiation and cell cycle exit. Furthermore MAD1 is involved in the induction of
senescence and inhibits apoptosis, which is in line with the MAD1 knockout phenotype.
-/-Neutrophilic progenitor cells of mad1 mice show accelerated cell divisions prior to terminal
differentiation and in addition terminally differentiated cells are highly sensitive to apoptosis-
inducing conditions.
In the present study the regulation of MAD1 expression in response to TGFβ1 was examined
in the promyelocytic cell line U937. The analysis of the TGFβ-associated signalling pathways
revealed a critical role of the MAP kinase p38. This kinase is necessary but not sufficient to
activate the MAD1 promoter in resp onse to TGFβ1 and cellular stress, indicating that
additional signals are required for efficient MAD1 induction. The MAD1 promoter is a TATA-
less CpG island promoter containing a region of high sequence homology, which is
characterized by an open, poorly structured chromatin. The proximal promoter possesses
several transcription factor recognition motifs including two CCAAT- and GC-boxes and an
E-box element. The C/EBP family members C/EBPα and C/EBPβ are constitutively bound to
the promoter in cells and capable to activate reporter genes that are controlled by the
proximal MAD1 promoter. In vitro C/EBPα and C/EBPβ bind as heterodimer to one of the
CCAAT-boxes. However, for reporter gene expression both CCAAT-boxes are relevant to
mediate C/EBPβ responsivene ss. In addition C/EBPβ co -operates with SP1, a GC-box
binding factor, in the activation of the MAD1 promoter and, consistent with this observation,
one CCAAT- and one GC-box are critical to mediate this co-operativity. Similarly to C/EBPα
and C/EBPβ, SP1 is constitutively bound to the MAD1 promoter. Moreover C/EBPα was
observed to co-operate with SMAD3 in the activation of the MAD1 promoter whereas other
SMAD proteins were inactive, indicating that a non-conventional TGFβ1-SMAD signalling
complex is important to regulate MAD1 expression.
Another factor constitutively bound to the MAD1 promoter is c-MYC. The analysis of the
functional relevance of c-MYC for MAD1 expression revealed that c-MYC functions as a
repressor of C/EBPβ-induced activation of the MAD1 promoter. Both factors interact in vivo
and c-MYC impairs the binding of the C/EBPα-C/EBPβ heterodimer to the CCAAT-box 1.
In addition to the constitutively bound sequence-specific transcription factors, the MAD1
promoter is occupied by a pre -assembled Pol II complex and the promoter-associated
III chromatin has all the hallmarks of an active promoter region. Histone H3 located at the
MAD1 promoter is highly acetylated and carries trimethylated H3K4, modifications that are
linked to active transcription. These modifications are not affected by stimulation with TGFβ1,
suggesting that this cytokine regulates further downstream events relevant for the activation
of the polymerase. TGFβ1 stimulation initiates a switch of the phosphorylation of the Pol II C-
terminal domain from Ser-5 to Ser-2. This change is typically associated with a change from
the initiation to the productive elongation mode of Pol II. In agreement with this finding, the
elongating Pol II progresses into the gene body and can be found associated with further
downstream DNA regions. Together these findings suggest that the MAD1 promoter is
assembled in a pre-activated state, which is responsive to various signalling pathways and
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