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Publié par | ludwig-maximilians-universitat_munchen |
Publié le | 01 janvier 2009 |
Nombre de lectures | 14 |
Langue | Deutsch |
Poids de l'ouvrage | 4 Mo |
Extrait
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades
der Fakultät für Chemie und Pharmazie
der Ludwig-Maximilians-Universität München
Translokation des Prion-Proteins ins
endoplasmatische Retikulum:
die Rolle intrinsischer und zellulärer Faktoren
Margit Miesbauer
aus
Schärding
2009 Erklärung
Diese Dissertation wurde im Sinne von § 13 Abs. 4 der Promotionsordnung vom 29.
Januar 1998 von Herrn Prof. Dr. Jörg Tatzelt betreut und von Frau PD Dr. Konstanze
F. Winklhofer vor der Fakultät für Chemie und Pharmazie vertreten.
Ehrenwörtliche Versicherung
Diese Dissertation wurde selbständig, ohne unerlaubte Hilfe erarbeitet.
München, am 16.01.2009
Dissertation eingereicht am 20.01.2009
1. Gutachter : Prof. Dr. Jörg Tatzelt
2. Gutachter: Prof. Dr. F.-Ulrich Hartl
Mündliche Prüfung am 01.04.2009
Danksagung
Zuerst möchte ich mich bei meinem Betreuer Prof. Dr. Jörg Tatzelt für die außerordentliche
Unterstützung, die engagierte Betreuung sowie die vielen Diskussionen und Anregungen
während der letzten Jahre herzlichst bedanken. Auch PD Dr. Konstanze F. Winklhofer
möchte ich für die sehr gute Zusammenarbeit und Betreuung sowie die bereitwillige
Übernahme der Fachvertretung danken.
Ein großer Dank gilt Prof. Dr. F.‐Ulrich Hartl für die Übernahme des Zweitgutachtens dieser
Dissertation.
Prof. Dr. Christian Haass danke ich für die wissenschaftliche Unterstützung und seine
anregenden Fragen und Ideen.
Des Weiteren danke ich der gesamten Arbeitsgruppe der Abteilung Zelluläre Biochemie am
Max‐Planck‐Institut und allen Kollegen am Adolf‐Butenandt‐Institut für ihre Hilfs‐
bereitschaft und die gute Zusammenarbeit.
Bedanken möchte ich mich natürlich auch bei der gesamten Arbeitsgruppe Tatzelt und
Winklhofer und hierbei besonders bei Veronika für die tatkräftige Unterstützung im Labor
sowie bei Julia, Lena, Kerstin, Uli, Vignesh, Natalie, Kathrin, Anna, Benjamin, Elisabeth und
Vicky. Ganz besonderer Dank gilt Geli, Anita und Mareike, die abgesehen von ihren
großartigen fachlichen Tipps und Tricks im Labor meine Dissertation zu einer ganz
besonderen Zeit in meinem Leben gemacht haben und mir die besten Freunde geworden
sind! An dieser Stelle möchte ich mich auch bei Markus für seine fortwährende
Hilfsbereitschaft bedanken.
Mein tiefster Dank gilt meiner Familie, die immer für mich da ist. Ihre Unterstützung und ihr
Rückhalt in allen Lebenslagen haben mir meinen bisherigen Weg sehr geebnet und mir
unendlich viel geholfen. Schließlich möchte ich von ganzem Herzen Jiri für seine Geduld und
die manchmal notwendige Zerstreuung und Aufmunterung während der letzten Jahre
danken.
„Es war sehr schön, es hat mich sehr gefreut!“
(Kaiser Franz Joseph et al., 1830‐1916) Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG 1
1.1 Prion-Erkrankungen 1
1.1.1 Einführung 1
1.1.2 Prion-Erkrankungen beim Tier 1
1.1.2.1 Scrapie 1
1.1.2.2 Bovine spongiforme Enzephalopathie 2
1.1.2.3 Chronisch zehrende Hirschkrankheit 3
1.1.3 Prion-Erkrankungen beim Mensch 4
1.1.3.1 Pathologie und Symptomatik humaner Prion-Erkrankungen 7
1.2 Das Prion-Protein 9
1.2.1 Identifikation des infektiösen Agens 9
C Sc1.2.2 Unterschiede zwischen PrP und PrP und Konversionsmodelle 10
1.2.3 PrP- und PrP-ähnliche Gene 11
1.2.4 Biogenese und zelluläre Lokalisierung von PrP 13
1.2.5 Struktur von PrP 14
1.2.6 PrP und verwandte Proteine im Zebrabärbling (Danio rerio) 16
1.3 Funktion von PrP 18
1.3.1 PrP knockout Mäuse 18
1.3.2 Neuroprotektivität von PrP 19
1.3.3 Rolle von PrP in der Signaltransduktion 20
1.3.4 Kupferbindung von PrP 21
1.4 Missfaltung von PrP und Neurodegeneration 22
Sc C1.4.1 PrP führt nur in Anwesenheit von neuronal exprimiertem PrP zur Neurodegeneration 23
Sc1.4.2 PrP-Mutanten führen in Abwesenheit von PrP zu Neurodegeneration 24
1.5 Maturierung und Faltung sekretorischer Proteine 26
1.5.1 Proteinsynthese am ER 27
1.5.2 Prozessierung der Proteine im ER und Golgi-Apparat 29
1.5.3 Proteinfaltung, Qualitätskontrollmechanismen und Proteinabbau 32
1.5.3.1 Calnexin-Zyklus 33
1.5.3.2 ER-assoziierte Degradierung 34
1.5.3.3 UPR 35
1.5.3.4 Kotranslokationale Qualitätskontrolle 36
1.6 Zielsetzung 39
Inhaltsverzeichnis
2 ERGEBNISSE 40
2.1 Teil 1 - Translokation von PrP ins ER: die Rolle intrinsischer und zellulärer Faktoren 40
2.1.1 Teil 1A - Generierung eines Mausmodells für die GSS-Mutante Q160X 41
2.1.1.1 Generierung einer PrP-Q159X überexprimierenden transgenen Mauslinie 41
2.1.1.2 Analyse der Proteinexpression transgener Q159X-Mäuse 42
2.1.1.3 r mRNA-Levels transgener Q159X-Mäuse 43
2.1.1.4 Zusammenfassung 45
2.1.2 Teil 1B - Analyse der intrinsischen und zellulären Faktoren, die für eine effiziente
Translokation von PrP ins ER notwendig sind 47
2.1.2.1 Die C-terminale GPI-Signalsequenz ist für den ER-Import entbehrlich, spielt aber eine
Rolle bei der Umwandlung von mannosereichen Glykanen in komplexe Glykane 48
2.1.2.2 α-helikale Bereiche sind wichtig für einen effizienten ER-Import 51
2.1.2.3 Die Einführung einer zusätzlichen N-terminalen Konsensussequenz für
N-Glykosylierung erleichtert die Analyse des ER-Imports 52
2.1.2.4 Die Effizienz des ER-Imports korreliert mit der Ausdehnung der α-helikalen Bereiche 54
2.1.2.5 α-helikale Bereiche sind für einen effizienten ER-Import ausreichend 55
CHO2.1.2.6 A115X/31 wird offensichtlich kotranslokational degradiert 56
2.1.2.7 115 α α wird unabhängig von einer N-verknüpften Glykosylierung und der Ausbildung 2 3
einer Disulfidbrücke erfolgreich ins ER importiert 57
2.1.2.8 Die Länge und möglicherweise die Lage der α-helikalen Domänen modulieren den ER-
Import 59
2.1.2.9 Eine unglykosylierte Fraktion von 115 α α wird nicht in das ER importiert sondern 2 3
kotranslokational degradiert 60
2.1.2.10 α-helikale Bereiche heterologer Proteine fördern den ER-Import von PrP 62
2.1.2.11 In vitro Analyse des ER-Imports 64
2.1.2.12 Effiziente heterologe ER-Signalsequenzen können den ER-Import unstrukturierter
Polypeptide nicht fördern 65
IPK2.1.2.13 p58 fördert die kotranslokationale Degradierung von sekretorischen Proteinen mit
ausgedehnten unstrukturierten Bereichen am N-Terminus 67
2.1.2.14 115 α α wird unter ER-Stressbedingungen vermindert in das ER importiert 70 2 3
2.1.2.15 Zusammenfassung 72
2.2 Teil 2 - Biochemische Charakterisierung von PrP-Homologen aus dem Zebrabärbling
(Danio rerio) 75
2.2.1 Generierung von zePrP1 und zeSho2 und Expression in murinen Neuroblastomzellen 76
2.2.2 zePrP1 und zeSho2 werden ins ER importiert und N-glykosyliert 77
2.2.3 n mit einem GPI-Anker modifiziert und sind an der Außenseite der
Plasmamembran lokalisiert 81
2.2.4 Zusammenfassung 84
Inhaltsverzeichnis
3 DISKUSSION 85
3.1 Teil 1 - Translokation von PrP ins ER: die Rolle intrinsischer und zellulärer Faktoren 85
3.1.1 ER-Import von PrP: Die Rolle der N-terminalen Signalsequenz und der HD 85
3.1.2 Die Sekundärstruktur ist ein Signal für effizienten ER-Import 86
3.1.3 Wie kann die Sekundärstruktur Einfluss auf die Translokation ausüben? 88
3.1.4 Die Regulation der Translokation - ein früher Qualitätskontrollmechanismus? 89
3.1.5 Die physiologische