Vectorisation du cisplatine via des nanoparticules à base de nucléolipides, Vectorization of cisplatin by nanoparticles based in nucleolipids

Salim Khiati

Description

Sous la direction de Philippe Barthélémy
Thèse soutenue le 28 octobre 2010: Bordeaux 2
Le cisplatine est l’un des trois agents anticancéreux les plus utilisés en chimiothérapie contre les tumeurs solides. Cependant, les doses utilisées sont limitées par des effets secondaires importants et l’existence des résistances innées ou acquises vis-à-vis de cette drogue. Ce travail vise à augmenter l’index thérapeutique du cisplatine (réduire ses effets secondaires et augmenter son activité anti-tumorale). Pour cela des nanoparticules hautement chargées en cisplatine en couche par couche à base de nucléolipides ont été préparées. Les études physico-chimiques (TEM, DLS, XPS, microscopie à fluorescence, ICP-optique) ont révélé que les nanoparticules à double couche étaient plus stables en milieu biologique par rapport aux formulations en mono-couche. Les études biologiques réalisées sur deux lignées tumorales ovariennes (IGROV1 et SKOV3) ont montré que cette formulation améliore l’activité cytotoxique du cisplatine et inhibe le développement des résistances. L’étude du mécanisme d’action (internalisation, apoptose, génotoxicité, réplication de l’ADN) a confirmé que les nanoparticules à double couche augmentent le taux de cisplatine internalisé qui, une fois libéré dans les cellules, arrête la réplication de l’ADN et induit la mort cellulaire par apoptose. Aucune toxicité intrinsèque aux nano-objets n’est observée. Les études in vivo de ces nanoparticules à double couche après injection en intraveineuse de 5, 7 et 9 mg/Kg ont révélé que cette formulation augmente la dose maximale tolérée et présente une activité anti-tumorale vis-à-vis des lignées cellulaires PROb et GV1A1. Cette stratégie d’élaboration des nanoparticules en couche par couche de nucléolipides nous a permis d’insérer des PEG avec ou sans acide folique pour le ciblage et d’introduire une deuxième drogue lipophile, le paclitaxel. Les tests in vitro (cytotoxicité, internalisation) ont montré l’intérêt de ces modifications.
-Cisplatine
-Nanoparticules
-Nucléolipides
-Couche par couche
-Caractérisation physico-chimique
-Évaluation in vitro et in vivo
-Lignées cellulaires IGROV1 et SKOV3
Cisplatin is one of the three most commonly used anticancer drugs in chemotherapy against solid tumors. However, the doses used are limited by significant side effects and the existence of resistance. The aim of this work is to increase the therapeutic index of cisplatin. For this purpose, highly charged nucleolipids nanoparticles “layer-by-layer” of cisplatin were prepared. The physico-chemical studies (TEM, DLS, XPS, ICP, Fluorescence microscopy) revealed that the bilayer nanoparticles were more stable in biological environment compared with mono-layer formulations. Biological studies carried in two ovarian carcinoma cells lines (IGROV1 and SKOV3) showed that this formulation enhances the cytotoxic activity of cisplatin and inhibits the development of resistance. The study of the mechanism of action (internalization, apoptosis, genotoxicity, DNA replication) demonstrated the nanoparticles with double layer increases the rate of cisplatin internalized then released into the cells, stops the replication of DNA and induces cell death by apoptosis. No intrinsic toxicity of nano-objects is observed. In vivo studies of these nanoparticles double layer after intravenous injection of 5, 7 and 9 mg/Kg in the rats showed this formulation increases the maximum tolerated dose and has an antitumor activity against PROb en GV1A1 cells lines. This strategy of developing layer-by-layer nucleolipids nanoparticles allows to insert PEG with or without folic acid for targeting and introducing second drug, a lipophilic paclitaxel. In vitro study (cytotoxicity, internalization) have shown the benefits of both modification.
-Cisplatin
-Nanoparticles
-Nucleolipids
-Layer-by-layer
-Physico-chemical characterization
-In vitro and in vivo study
-IGROV1 and SKOV3 cells lines
Source: http://www.theses.fr/2010BOR21741/document

Sujets

• Cisplatine
• Nanoparticule

Informations

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• Nombre de lectures: 116
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 3 Mo

Extrait

UNIVERSITE VICTOR SEGALEN DE BORDEAUX 2
Ecole doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé


THESE

présentée par
SALIM KHIATI

pour obtenir un
DOCTORAT DE L ’UNIVERSITE de BORDEAUX 2
Mention : Sciences, Technologies, Santé
Option : Biochimie

Sujet de thèse
Vectorisation du cisplatine via des nanoparticules à base
de nucléolipides

Soutenance le 28 octobre 2010






Membres du jury
Isabelle Rico-Lattes Directrice de Recherche CNRS TOULOUSE Rapporteur
UMR5623

Bruno Chauffert Professeur CHU Amiens Sud AMIENS Rapporteur

Fréderic LAGARCE Maître de conférences INSERM ANGERS Examinateur
U646, Université d’Angers
Michel Camplo Maître de conférences CNRS MARSEILLE Examinateur
CINaM, Université d’Aix-Marseille 2
Philippe Barthélémy Professeur INSERM U869 BORDEAUX Directeur de thèse
Université de Bordeaux 2 Remerciements

Ce travail a été réalisé au sein du laboratoire INSERM U869 ARN : régulation naturelle et
artificielle à l’université de Bordeaux 2. Mes premiers remerciements vont au Dr. Jean-
Jacques Toulmé, directeur de l’unité INSERM U869, qui m’a accueilli et qui m’a permis de
réaliser ce travail au sein de son laboratoire.

Je souhaite également remercier le professeur et oncologue au CHU d’Amiens Bruno
Chauffert qui m’a fait l’honneur d’accepter de juger ce travail. Je le remercie pour son
implication concernant ce travail et pour les différentes discussions (réunions ANR et séjours
à Dijon) toujours fort enrichissantes.

Je remercie vivement le Dr. Isabelle Rico-Lattes, directrice de recherche au laboratoire des
IMRCP, équipe SMODD, UMR 5623,à Toulouse, qui m’a fait l’honneur d’être rapporteur.

J’adresse mes sincères remerciements au Professeur Jean-Pierre Benoit, directeur de l’unité
INSERM U646, ingénierie de la vectorisation particulaire à Angers, et au Professeur et
neurologue François Berger, directeur du centre de nanomédecine et cerveau à Grenoble qui
m’ont fait l’honneur de faire partie du jury de thèse.

Je souhaiterais remercier Michel Camplo, maître de conférences à Aix-Marseille II. Je le
remercie d’avoir eu une attention soutenue tout au long de nos travaux et d’avoir accepté de
participer au jury de thèse.

Je remercie tout particulièrement le Pr. Philippe Barthélémy, mon directeur de thèse, dont
j’ai beaucoup appris durant mon parcours. Je le remercie pour toutes ces critiques
constructives qui m’ont permis de concevoir et d’accomplir ce travail.

Je tiens vivement à remercier Nathalie Pierre pour la synthèse des nucléolipides anioniques,
le Dr. Delphine Luvino pour la synthèse de la fameuse DOTAU, le Dr. Khalid Oumzil pour
la synthèse du nucléolipide-PEG, le Dr. Claire Cébalos pour la synthèse de la DOTAU
également. Je les remercie pour leur réactivité.

Je tiens à remercier le Dr. Bernard Rayner pour les discussions scientifiques et non
scientifiques, ses suggestions éclairées et pour ses précieuses corrections.

Sandrine Chabas, je te remercie pour ta disponibilité et tes conseils sur les manipulations,
sans cela, la recherche au sein de ce laboratoire n’aurait pas été aussi agréable et
productive.

Je tiens à remercier également le Dr. Cathy Staedel pour ses conseils, son dynamisme et sa
disponibilité.

Merci à Fabien Darfeuille pour ces discussions (débit rapide) très enrichissantes et
stimulantes avec qui j’ai compris le sens du mot ‘‘recherche’’.
Merci aux maîtres de conférence Laurent Azémat, Isabelle Bestelle et Arnaud Gissot pour
leurs critiques scientifiques constructives et efficaces lors des réunions de l’équipe.

Je tiens à remercier vivement notre Kati Ba-Pierozzi pour ses solutions à nos problèmes
administratifs.

Merci à toutes les personnes qui ont permis de rendre le travail au quotidien plus agréable et
plus motivant, je pense à Cédric Bélair (meurs pas avant ta soutenance !), Jérémy Reignier
(une nouvelle blague ?), Hélène Arnion (vive le rhum !...), Jean-Jacques Puyol (bientôt les
champignons !), Ahissan Aimé (alors ces QD ?), Jessica Baud (maman ?), Christelle Dolain
(entraîne-toi avant le ski !), Sonia Da Rocha Gomes (vive la salade !).

Je remercie ma famille : mes sœurs Soraya, Farida et Hassina et mes frères, Abdelkader,
Hamou et Salah et mes deux grand-mères, Louiza et Saadia.


Je dédie ce travail à mes parents.
Abréviations

°C : degré Celsius
µg : microgramme
µL : microlitre
5-FU : 5-FluoroUracile
7-AAD : 7-AminoActinomycin D
ADN : Acide DésoxyriboNucléique
AF : Acide Folique
araC : arabinoCytosine
ARN : Acide RiboNucléique
ATP : Adénosine TriPhosphate
AZT : 3’-AZido-3’-désoxyThymidine
Borat : Acide Borique
BrdU : BromodéoxyUridine
BSA : Bovine Serum Albumin
CDDP : Cis-DiamineDichloroPlatine (II)
CMC : Concentration micellaire Critique
DiC T : 3’-(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphate) Thymidine 16
DMSO : DiMéthyl-SulfOxide
DOPC : 1,2-DiOleoyl-sn-glycéro-3-PhosphoCholine
DOPE : 1,2-DiOleoyl-sn-glycéro-3-PhosphatidylEthanolamine
DOPS : 1,2-DiOleoyl-sn-glycéro-3-[Phospho-L-Sérine]
DOTAP : (N-[1-(2,3-DiOleoylloxy)-propyl]-N’,N’,N’-TriméthylAmmonium chloride
DOTAU : N-[5’-(2’,3’-DiOleoyl)Uridine]-N’,N’,N’-TriméthylAmmonium Tosylate
ECACC : European Collection of Animal Cell Culture
EDTA : Ethylène Diamine Tetra Acétique
FACS : cytométrie en flux (Fluorescence Activated Cell Sorter)
FITC : Fluorescéine IsoThioCyanate
ICP : Inductively Coulped Plasma
IP : Iodure de Propidium
IRM : Imagerie par Résonance Magnétique
IV : Intraveineuse MET : Microscopie Electronique à Transmission
MTS : (3-(4,5-diMéthylThiazol-2-yl)-5-(3-carboxyméthoxyphényl)-2-(4-Sulfophényl)-2H-
tétrazolium)
NP- : nanoparticules à base de nucléolipides en mono-couche
NP+ : nanoparticules à base de nucléolipides à double couche
NPs : NanoParticules
OMS : Organisation Mondiale de la Santé
P/S : Penicilline/Streptamycine
PBS : Phosphate Buffered Saline
PDT : PhotoThérapie Dynamique
PEG : PolyEthylèneGlycol
PS : nanoparticules à base de phospholipides (DOPS) en mono-couche
Rf : facteur de Rétention
RGD : arginine-glycine-acide aspartique
Rpm : Rotation par minute
RPMI : Roswell Park Memorial Institute Medium
SC : Sous-Cutané
SVF : Sérum de Veau Fœtal
TA : Température Ambiante
TEM : Transmission Electron Microscopy
Tris : Trishydroxyméthylaminométhane
UA : Unités Arbitraires
XPS : X-ray Photoelectron Spectroscopy SOMMAIRE

I. INTRODUCTION GENERALE ................................................................. 4
II. INTRODUCTION & BIBLIOGRAPHIE .................................................. 7
1. Les généralités ............................................................ 7
1.1. Le cancer ............................................................. 7
1.2. Les causes du cancer ........................................................................... 8
1.3. Les traitements .................................................... 9
2. Le cisplatine ............................................................................................. 13
1.2. La découverte du cisplatine ............................... 13
1.3. La cible du cisplatine ......................................................................................................... 15
1.4. Le mécanisme d’action ...... 16
1.5. Les problèmes liés au cisplatine ........................................................................................ 18
1.6. L’amélioration de l’activité du cisplatine .......... 27
3. La vectorisation du cisplatine ................................................................................................ 31
3.1. L’origine de la vectorisation .............................. 31
3.2. Les trois avancées majeures de la vectorisation 32
3.3. La comparaison entre ciblage passif et ciblage actif ......................................................... 37
3.4. Les différentes générations de vecteurs ............................................. 40
3.5. Les caract