MINISTERE DE LA JEUNESSE DE L'EDUCATION NATIONALE

MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE
ET DE LA RECHERCHE

ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES
Sciences de la Vie et de la Terre

MEMOIRE présenté par
Magalie PENAUD-BUDLOO

pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes

Etude des formes à 2-LTR d'ADN rétroviral lors des
étapes précoces de l'infection par un vecteur recombinant
dérivé du Virus Leucémogène Murin

Soutenu le 26 octobre 2005, devant le jury suivant :
Pr Max BERGOIN Président du jury
Dr Marc SITBON Examinateur
Dr Philippe MOULLIER Directeur Scientifique
Dr Geneviève CORDIER Responsable EPHE

philippe.moullier@univ-nantes.fr
Laboratoire de Thérapie Génique - INSERM UMR U649
30 Bd Jean Monnet
44035 Nantes Cedex 01
geneviève.cordier@univ-lyon1.fr
Laboratoire EPHE ‘Interactions cellulaires, rétrovirus et cancer’
IFR 128 Biosciences Lyon-Gerland UMR 754
INRA-ENVL-UCBL‘Rétrovirus et pathologie comparée’
50 avenue Tony Garnier
69366 Lyon cedex 07
RESUME

Depuis une dizaine d’années, l’avancée des connaissances sur les rétrovirus tel que le HIV-1 est
fulgurante, notamment en ce qui concerne le cycle du virus dans la cellule hôte. Après l’entrée du
rétrovirus dans le cytoplasme de la cellule, le génome viral ARN est rétro-transcrit en ADN double
brin linéaire flanqué par deux séquences terminales répétées, les LTR (Long Terminal Repeat). Cet
ADN est acheminé jusqu’au noyau au sein d’un complexe de préintégration, le PIC. Dans le cas du
EPHE Banque de Monographies SVT 1MLV, un gammarétrovirus, le passage du PIC dans le noyau ne peut se faire que lors de la rupture de
l’enveloppe nucléaire c’est-à-dire pendant la mitose, ce qui n’est pas le cas des lentivirus comme le
HIV qui ont la capacité d’infecter des cellules quiescentes. Arrivé dans le noyau, l’ADN s’intègre
dans le génome cellulaire. Cette propriété est utilisée en thérapie génique pour introduire de façon
stable un gène ‘médicament’ au sein de la cellule ciblée. Un autre devenir est possible pour l’ADN
viral, la circularisation. Plusieurs types de cercles ont été décrits. Les cercles à 2-LTR issus d’une
simple ligation des deux LTR de l’ADN linéaire sont considérés comme strictement nucléaires et
donc comme un index de l’import nucléaire du PIC. Notre étude remet en cause ce dogme en
montrant la présence de jonctions U5-U3, caractéristiques des formes à 2-LTR, dès 2 heures après
infection avec un vecteur dérivé du MLV dans le cytoplasme des cellules TE671. Parallèlement, on
constate par analyse en PCR quantitative l’apparition précoce de ces jonctions sur des cellules 3T3
NIH arrêtées en phases G1 à S du cycle cellulaire par traitement à l’aphidicoline. Des expériences
complémentaires menées sur un modèle de cellules primaires, les lymphocytes T CD4+, suggèrent
que la formation des jonctions est dépendante du passage en phase G2 et non de la mitose. Nos
résultats prouvent qu’il est nécessaire de réévaluer l’utilisation de la détection des jonctions U5-U3 en
tant que marqueur de l’import de l’ADN rétroviral dans le noyau.

Mots Clés : Rétrovirus - MLV - jonctions 2-LTR - localisation cytoplasmique -
cycle cellulaire - lymphocytes T CD4+
SOMMAIRE

Liste des abréviations 5
Préambule 7

INTRODUCTION 9

1. Caractéristiques du virus de la leucémie murine (MLV)
et des vecteurs dérivés 9

1.1 Génome du rétrovirus MLV 9
1.2 Structure du MLV 10
1.3 Tropisme 11
1.4 Cycle réplicatif du MLV sauvage 12
1.4.1 Etapes précoces 12 a- L’entrée du virus dans la cellule cible
b- La transcription inverse c- L’import nucléaire de l’ADN viral d- Entrée dans le noyau
e- L’intégration
1.4.2 Etapes tardives 17 a- La transcription virale
b- La synthèse des protéines virales c- L’assemblage et le bourgeonnement des particules
EPHE Banque de Monographies SVT 2 d- La maturation des virions
1.4.3 Les formes d’ADN rétroviral non intégrées 20

1.5 Les vecteurs rétroviraux dérivés du MLV 21
1.5.1 Constitution d’un génome recombinant MLV : concepts généraux 21 1.5.2 Production transitoire de particules rétrovirales 22
1.5.3 Production stable 23
1.5.4 Les vecteurs hybrides 23
1.5.5 Limites et améliorations des vecteurs rétroviraux 24
a- Le pseudotypage
b- Génération de particules compétentes pour la réplication
c- Limitations des effets mutagènes du MLV

1.6 Rôle du cycle cellulaire dans l’infection rétrovirale 25
1.6.1 Rappels sur le cycle cellulaire 25
1.6.2 Arrêt du cycle cellulaire 26
a- Synchronisation en phase G0 b- Arrêt en phase G1 à S c- en G2
d- Arrêt avant la fin de la mitose
1.6.3 Influence du cycle cellulaire sur l’infection rétrovirale :
comparaison MLV et autres rétrovirus 28
2. Etude bibliographique sur les formes d’ADN rétroviral à 2-LTR
et sur le modèle d’infection des lymphocytes T primaires 31

2.1 Les formes à 2-LTR issues d’une ligation 31
2.1.1 Cercles à 2-LTR et intégration 31
2.1.2 Localisation nucléaire et cinétique de formation 32
2.1.3 Partenaires protéiques intervenant dans la voie de circularisation 33
a- Protéines de la voie de réparation de l’ADN (NHEJ)34 b- Protéine BAF (Barrier to Auto-integration Factor)
2.1.4 Stabilité des cercles à 2-LTR 34
2.1.5 Activité transcriptionnelle de l’ADN extrachromosomique 36

2.2 Infection des lymphocytes T par un rétrovirus 37
2.2.1 Restriction de l’infection dans les lymphocytes T quiescents 37
a- Etape de transcription inverse
b- d’import nucléaire de l’ADNc c- Intégration défective d- Facteurs de restriction
2.2.2 Conditions optimales d’infection des lymphocytes T 40
a- Améliorer la réaction de transcription inverse
Ajout de déoxynucléotides
Séquence cPPT
b- Influencer l’état d’activation des lymphocytes T Les cytokines Activation TCR et molécules de costimulation
c- Conditions de production des vecteurs rétroviraux

CONCLUSION 44

EPHE Banque de Monographies SVT 3BIBLIOGRAPHIE 45



LISTE DES ABREVIATIONS

7-AAD : 7-Amino Actinomycine D
AAV : Adeno-Associated Virus
ADNc : Acide désoxyribonucléique complémentaire
ALSV : Avian Leukosis Sarcoma