Utilización de dos soportes para la inmovilización de la papaína (Use of two supports for inmobilizing papain)

Biassutti Ear

Description

Resumen
Con la intención de preparar suplementos dietéticos de bajo coste, se inmovilizó papaína en carbón activado (CA) y en alúmina, utilizando suero como fuente de proteínas hidrolizadas. Para determinar el índice de inmovilización se cuantifi caron las enzimas no adsorbidas mediante el método de Lowry. Se analizó el efecto del tiempo de contacto y la temperatura, considerándose 30 min. a 25 ºC como la condición óptima para inmovilizar la papaína en ambos soportes. El CA presentó unos índices de inmovilización muy superiores (entre 95% y 99%) a los de la AL (entre 4% y 13%). Para evaluar la capacidad de reutilización de la papaína se midió la actividad residual de la enzima después de haber sido utilizada hasta 20 veces. Para determinar la actividad de la enzima se cuantifi có el índice de exposición de la fenilalanina mediante espectrofotometría de derivada segunda. En este caso, la AL presentó mejores resultados que el CA, ya que la actividad de la papaína seguía siendo la misma después de haber sido utilizada 15 y 5 veces, respectivamente.
Abstract
Papain was immobilized on activated carbon (AC) and on alumina (AL), with the aim of preparing low cost dietary
supplements, using whey as hydrolysed protein source. The quantifi cation of the non-adsorbed enzyme, using Lowry?s method was used to determine the immobilization rate. The effect of the contact time and the temperature was tested, and 30 min at 250C was considered the best condition for immobilizing papain in both supports. AC showed much higher immobilization rates (from 95% to 99%) than AL (from 4% to 13%). The reusability of papain was evaluated by measuring the residual activity of the enzyme after it has been used for up to 20 times. The quantifi cation of exposure rate of phenylalanine by second derivative spectrophotometry was used to determine the enzyme activity. In this case, AL showed better results than AC, since the activity of papain remained unchanged after 15 and 5 times, respectively.

Sujets

• Carbón activado
• Alúmina
• Temperatura
• Activated carbon

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• Publié par: erevistas
• Publié le: 01 janvier 2007
• Nombre de lectures: 26
• Langue: Español

Extrait

UTILIZACIÓN DE DOS SOPORTES PARA LA INMOVILIZACIÓN DE LA PAPAÍNA 425
USE OF TWO SUPPORTS FOR INMOBILIZING PAPAIN
Utilización de dos soportes para la
inmovilización de la papaína
Use of two supports for inmobilizing papain
1 1 1 1 1*BIASUTTI EAR, DE MARCO LM, AFONSO WO, SILVA VDM, LOPES DCF, SILVESTRE MPC
1 Depto. de Alimentos/Fac. de Farmácia/UFMG- sala 3070-B3, Av. Antônio Carlos 6627- cep. 31270-901 –
Belo Horizonte, MG, Brasil
*E-mail: [e-mail]
RESUMEN
Con la intención de preparar suplementos dietéticos de bajo coste, se inmovilizó papaína en carbón activado (CA) y
en alúmina, utilizando suero como fuente de proteínas hidrolizadas. Para determinar el índice de inmovilización se
cuantifi caron las enzimas no adsorbidas mediante el método de Lowry. Se analizó el efecto del tiempo de contacto
y la temperatura, considerándose 30 min. a 25 ºC como la condición óptima para inmovilizar la papaína en ambos
soportes. El CA presentó unos índices de inmovilización muy superiores (entre 95% y 99%) a los de la AL (entre
4% y 13%). Para evaluar la capacidad de reutilización de la papaína se midió la actividad residual de la enzima
después de haber sido utilizada hasta 20 veces. Para determinar la actividad de la enzima se cuantifi có el índice de
exposición de la fenilalanina mediante espectrofotometría de derivada segunda. En este caso, la AL presentó mejores
resultados que el CA, ya que la actividad de la papaína seguía siendo la misma después de haber sido utilizada 15
y 5 veces, respectivamente.
PALABRAS CLAVE: Carbón activado. Alúmina. Tiempo de contacto. Estabilidad operativa. Inmovilización de papaína.
Temperatura.
ABSTRACT
Papain was immobilized on activated carbon (AC) and on alumina (AL), with the aim of preparing low cost dietary
supplements, using whey as hydrolysed protein source. The quantifi cation of the non-adsorbed enzyme, using Lowry’s
method was used to determine the immobilization rate. The effect of the contact time and the temperature was tested,
0and 30 min at 25 C was considered the best condition for immobilizing papain in both supports. AC showed much
higher immobilization rates (from 95% to 99%) than AL (from 4% to 13%). The reusability of papain was evaluated by
measuring the residual activity of the enzyme after it has been used for up to 20 times. The quantifi cation of exposure
rate of phenylalanine by second derivative spectrophotometry was used to determine the enzyme activity. In this case, AL
showed better results than AC, since the activity of papain remained unchanged after 15 and 5 times, respectively.
KEYWORDS: Activated carbon. Alumina. Contact time. Operational stability. Papain immobilization. Temperature.
Fecha de recepción: 14-11-06
Fecha de aceptación: 22-01-07
Ars Pharm 2006; 47 (4): 425-435.BIASUTTI EAR, DE MARCO LM, AFONSO WO, SILVA VDM, LOPES DCF, SILVESTRE MPC426
INTRODUCCIÓN INTRODUCTION
En las últimas décadas se ha prestado con- Considerable attention in the last few decades
siderable atención a la preparación de enzimas has been focused on the preparation of immo-
inmovilizadas, y se han desarrollado diversos bilized enzymes, and a variety of supports and
soportes y técnicas de inmovilización. En este techniques for immobilization has been deve-
sentido, se han explorado numerosos enfoques loped. In this way, numerous approaches have
para la preparación de enzimas inmovilizadas, been explored for the preparation of immobilized
debido a que presentan diversas ventajas so- enzymes because they have several advantages
1 1bre las enzimas en solución no digerible . Por over enzymes in bulk solution . Thus, the im-
tanto, la inmovilización facilita la recuperación mobilization leads to ease of recoverability and
2 2y reutilización de las enzimas . De hecho, en reusability of the enzymes . In fact, for large
producción a gran escala, el proceso sería más scale production, the process would be more
económico si se pudiera reutilizar la enzima, por economical if the enzyme could be reused, for
3,4 3,4ejemplo, mediante inmovilización . Además, example, by inmobilization . Moreover, these
estos sistemas pueden incrementar la estabilidad systems may increase the stability of enzymes
5de las enzimas en tratamientos térmicos y niveles to thermal treatments and extremes of pH .
5extremos de pH . Moreover, high concentration and even distri-
Asimismo, una elevada concentración e incluso bution of the enzyme, enhancing its operational
distribución de la enzima, mejorando su estabilidad stability have been mentioned by Moreno and
6operativa, ya ha sido mencionada por Moreno y Sinisterra (1994) as positive aspects of immobi-
6Sinisterra (1994) como aspecto positivo de la lization of enzymes on solid support, especially
inmovilización de enzimas en soportes sólidos, for industrial and clinical utilization. According
7especialmente en usos industriales y clínicos. to Kilinç et al. (2002) , immobilization imparts
7Según Kilinç et al. (2002) , la inmovilización stability to proteins by restricting the movement
aporta estabilidad a las proteínas, al restringir el of the protein molecule by attachment to an inert
movimiento de la molécula de proteína ligándola body via chemical bonds. The various domains
a un cuerpo inerte mediante enlaces químicos. De are therefore held in the correct orientation to
esta forma, los diversos dominios se mantienen en retain activity at least over and extended period
la orientación correcta para conservar la actividad of time when compared with enzymes in free
al menos durante un largo período de tiempo, en solution.
comparación con las enzimas en solución libre. Immobilization of enzymes has been carried
La inmovilización de las enzimas se ha efec- out by entrapment, ionic interaction, complex
tuado mediante atrapamiento, interacción iónica, formation with metal, covalent attachment, en-
formación compleja con metal, enlace covalente, capsulation and adsorption to hydrophobic or
8encapsulación y adsorción en superficies hidro- hydrophilic surfaces . Among these methods,
8fóbicas o hidrofílicas . Entre estos métodos, la adsorption has been considered as a simple and
9adsorción ha sido considerado el más simple economical method . Moreover, enzyme immo-
9y económico . Además, la inmovilización de bilization by adsorption has the benefit of wide
enzimas mediante adsorción tiene la ventaja de applicability and may provide relatively small
ofrecer mayores posibilidades de aplicación y perturbation of the enzyme native structure and
perturbar relativamente poco la función y estruc- function, which contributes to the maintenance
10tura naturales de la enzima, lo que contribuye a of the enzyme activity .
10mantener su actividad . Various techniques have been used to evaluate
11Para evaluar la cantidad de enzima adsorbida the amount of the adsorbed enzyme . Some of
11se han utilizado diversas técnicas . Algunas de them are based on the measurement of the decrea-
ellas se basan en la medición de la reducción de se in protein concentration in the solution after
la concentración proteica en la solución una vez the solid surface have come in contact with the
4,12,13,14 que la superficie sólida entra en contacto con la solution. For this purpose, some authors
4,12,13,14 15 3,816,17 solución. Con esta finalidad, algunos autores used the Lowry method and others the
15 3,816,17 18utilizaron el método de Lowry y otros el Bradford one .
18método de Bradford .
Ars Pharm 2006; 47 (4): 425-435.UTILIZACIÓN DE DOS SOPORTES PARA LA INMOVILIZACIÓN DE LA PAPAÍNA 427
USE OF TWO SUPPORTS FOR INMOBILIZING PAPAIN
Otras técnicas emplean la medición directa de Other techniques employ the direct measure-
las proteínas adsorbidas en la superficie, utilizando ment of proteins adsorbed on the surface, using
métodos más sofisticados tales como el análisis more sophisticated methods such as enzyme-linked
inmunosorbente ligado a enzimas, el radiomar- immunosorbent, radiolabeling, quartz crystal mi-
cado, el microbalance de cristales de cuarzo, la crobalance, ellipsometry, total internal reflection
11elipsometría, la fluorescencia de reflexión interna fluorescence and neutron reflection .
11total y la reflexión de neutrones . Papain is a cysteine endopeptidase, from Carica
La papaína es una cisteína endopeptidasa, papaya, stable at 4ºC but its acivity decreases
de la Carica papaya, estable a 4 ºC, pero cuya about 20% in 6 months. The pH suggested for its
19actividad disminuye aproximadamente un 20% use varies from 6.0 to 7.0 . This enzyme shows
a los 6 meses. El pH sugerido para su uso va- extensive proteolytic activity towards proteins,
19ría entre 6.0 y 7.0 . Esta enzima presenta una short-chain peptides, amino acid ester and amide
amplia actividad proteolítica haci